通用強(qiáng)大型真核表達(dá)系統(tǒng) —— 桿狀病毒與昆蟲(chóng)細(xì)胞

昆蟲(chóng)細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（IC-BEVS）是一類應(yīng)用廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)，在高表達(dá)蛋白的同時(shí)，具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾加工以及轉(zhuǎn)移外源蛋白的能力。同時(shí)由于其不存在任何對(duì)哺乳動(dòng)物有潛在威脅的動(dòng)物病毒片段，自1983年引入BEVS技術(shù)以來(lái)，桿狀病毒系統(tǒng)已成為用于重組蛋白表達(dá)的通用、強(qiáng)大的真核載體系統(tǒng)之一[1]。

桿狀病毒的分類、結(jié)構(gòu)表型和感染方式 桿狀病毒具有大的環(huán)狀雙鏈DNA基因組，其范圍約為80至180kbp。桿狀病毒科又分為四個(gè)屬：α桿狀病毒、β桿狀病毒、δ桿狀病毒和γ桿狀病毒[2]。

桿狀病毒已知的91種完全基因組中，α型桿狀病毒屬就有61種，因此病毒研究也為深入，包括苜蓿核型多角體病毒（AcMNPV）、家蠶核多角體病毒（BmNPV）、黃杉毒蛾多核衣殼核多角體病毒（OpMNPV）、棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒(HearNPV)等。從苜蓿環(huán)紋夜蛾中分離出的苜蓿核型多角體病毒（AcMNPV）是目前研究為廣泛的桿狀病毒之一[3]。

典型桿狀病毒感染周期的一個(gè)特征是產(chǎn)生兩種物理結(jié)構(gòu)上不同類型的病毒粒子。一種病毒體表型被稱為包涵體病毒（ODV），另一種被稱為芽狀病毒（BV）[4]。兩種病毒的形成時(shí)間不同，BV在病毒復(fù)制的早期開(kāi)始形成，含有單個(gè)核衣殼，外有GP64蛋白包被的囊膜，可以在昆蟲(chóng)體內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞間傳播。ODV在病毒復(fù)制的晚期開(kāi)始形成，含有一個(gè)或多個(gè)核衣殼，外有一層蛋白質(zhì)基質(zhì)包被。

在ODV病毒粒子的形態(tài)下，核衣殼在細(xì)胞核內(nèi)獲得包膜，隨后病毒粒子被封閉或包裹在結(jié)晶的蛋白質(zhì)基質(zhì)中，形成封閉體（OB）。ODV病毒粒子在昆蟲(chóng)之間傳播感染，特別容易感染昆蟲(chóng)中腸的上皮細(xì)胞。ODV感染中腸細(xì)胞后，BV病毒粒子從感染的中腸上皮細(xì)胞的基底表面出芽進(jìn)入血腔，并在受感染的動(dòng)物體內(nèi)從細(xì)胞到細(xì)胞和從組織到組織系統(tǒng)地傳播感染。對(duì)于AcMNPV等病毒，血腔內(nèi)的大多數(shù)組織（氣管上皮、血細(xì)胞、表皮、肌肉等）都會(huì)受到感染，并產(chǎn)生額外的BV，從而進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)傳播感染。BV 中有一種生物學(xué)功能較為突出的囊膜糖蛋白 Gp64，當(dāng)桿狀病毒通過(guò)質(zhì)膜出芽時(shí)獲得Gp64，缺失此蛋白時(shí)，將無(wú)法完成細(xì)胞間感染[5]。

解釋了感染的初級(jí)和次級(jí)階段。感染的主要階段發(fā)生在閉塞體（OBs）在高pH分解并將包涵體（ODV）病毒粒子釋放到中腸腔中。ODV病毒粒子穿過(guò)營(yíng)養(yǎng)膜后，與中腸上皮極化上皮細(xì)胞的微絨毛結(jié)合并融合，將核衣殼釋放到細(xì)胞質(zhì)中。在病毒復(fù)制和核衣殼在細(xì)胞核中組裝（或直接穿過(guò)）后，核衣殼被運(yùn)輸?shù)交踪|(zhì)膜，在那里它們出芽以產(chǎn)生出芽病毒（BV）表型。BV病毒粒子可能直接感染一些細(xì)胞（氣管細(xì)胞和血細(xì)胞），也可能在血淋巴中循環(huán)，感染其他組織，如脂肪體和肌肉。在感染的第二階段，其他組織的感染導(dǎo)致額外BV的產(chǎn)生，從而進(jìn)一步在動(dòng)物中傳播感染。ODV和OBs在所有細(xì)胞類型中產(chǎn)生，隨后在細(xì)胞裂解和動(dòng)物溶解或液化時(shí)釋放[4]。OBs是在動(dòng)物感染后期細(xì)胞裂解時(shí)從感染細(xì)胞中釋放出來(lái)的，通常，感染的昆蟲(chóng)會(huì)液化。這是一個(gè)由至少兩種病毒編碼的酶（幾丁質(zhì)酶和組織蛋白酶）介導(dǎo)的過(guò)程，它們催化昆蟲(chóng)外骨骼的分解把OBs釋放到環(huán)境中，完成自然界的感染循環(huán)。

在BV結(jié)合并通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入后，沿著微管運(yùn)輸，并且在酸化后，核衣殼（藍(lán)色）被釋放。P78/83 Arp2/3復(fù)合物的聚合導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)，肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)為在細(xì)胞質(zhì)中運(yùn)輸核衣殼和穿過(guò)核孔提供了推進(jìn)力。核衣殼在細(xì)胞核中的釋放導(dǎo)致病毒基因表達(dá)、DNA復(fù)制和子代核衣殼（藍(lán)色和綠色）在病毒基質(zhì)中的組裝。在核衣殼中，一些被標(biāo)記為從細(xì)胞核排出（藍(lán)色），另一些被標(biāo)記用于ODV產(chǎn)生（綠色）。在細(xì)胞質(zhì)小泡（運(yùn)輸小泡）中觀察到離開(kāi)細(xì)胞核的核衣殼，這些小泡將核衣殼釋放到細(xì)胞質(zhì)中[4]。

此外，ODV病毒粒子對(duì)昆蟲(chóng)中腸細(xì)胞的感染具有高度的特異性，必須克服的物理和生物障礙。另外ODV在環(huán)境中的穩(wěn)定性嚴(yán)重依賴于OB蛋白，OB蛋白圍繞并保護(hù)ODV病毒粒子免受干燥和可能的紫外線滅活。OB蛋白（在大多數(shù)桿狀病毒中稱為多角體蛋白）在OB中形成天然晶體，在該結(jié)構(gòu)中，多面體三聚體通過(guò)二硫鍵連接，形成十二聚體。

在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，感染是由BV病毒粒子引發(fā)的，因?yàn)镺DV病毒粒子在培養(yǎng)細(xì)胞中的傳染性很差，感染通常在幼蟲(chóng)中進(jìn)行。所以O(shè)DV在細(xì)胞培養(yǎng)中不具有感染性，在體外培養(yǎng)的同時(shí)也不需要多角體蛋白質(zhì)結(jié)晶的保護(hù)[6]。

昆蟲(chóng)細(xì)胞系培養(yǎng)及特點(diǎn) 在過(guò)去的幾十年里，已經(jīng)從6個(gè)種屬的100多種昆蟲(chóng)中分離出數(shù)百種昆蟲(chóng)細(xì)胞系[7]。鱗翅目細(xì)胞系主要與BEVS一起用于重組蛋白的表達(dá)和桿狀病毒生物殺蟲(chóng)劑的生產(chǎn)，特別是來(lái)自家蠶、蕓苔、草地貪夜蛾和毛滴蟲(chóng)屬的細(xì)胞系。其中，Sf-9、Sf-21、Tn-368和High Five是在工業(yè)應(yīng)用中應(yīng)用廣泛的細(xì)胞系。這些細(xì)胞系和相關(guān)細(xì)胞系高度易受加利福尼亞體多核多角體病毒（AcMNPV）和其他桿狀病毒的感染。 · Sf-21細(xì)胞系 第一個(gè)被廣泛用于研究和技術(shù)應(yīng)用的細(xì)胞系是Sf-21，這是一種由Vaughn及其同事于1977年建立的草地貪夜蛾S.frugiperda的卵巢細(xì)胞系，同時(shí)也是Sf-9細(xì)胞的克隆母系[9]。Sf-21細(xì)胞系研究的樣本可以達(dá)到比較均一性，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)一定代數(shù)后，所得到的細(xì)胞系則可以達(dá)到均一性而屬于同一類型的細(xì)胞。 · Sf-9細(xì)胞系 Sf-9細(xì)胞是源于雌性草地貪夜蛾蛹的卵巢組織，可以更好的用于復(fù)制桿狀病毒表達(dá)載體。Sf-9細(xì)胞系來(lái)源于Sf-21，是由Sf-21的克隆株篩選而來(lái)，與Sf-21相比，Sf-9對(duì)PH、滲透壓和剪切力的耐受性更好。Sf-21和Sf-9細(xì)胞系適用于桿狀病毒的感染、純化、高滴度病毒的生產(chǎn)和表達(dá)重組蛋白。Sf-9細(xì)胞的生長(zhǎng)和感染特性注定它在桿狀病毒的轉(zhuǎn)染與擴(kuò)增方面表現(xiàn)出色，并且Sf-9細(xì)胞系體積較小，大小規(guī)則，易于形成單層和鋪培養(yǎng)板。 · Tn-368細(xì)胞系 Tn-368和High Five都是來(lái)源于粉紋夜蛾（Tn）的細(xì)胞系，然而有研究發(fā)現(xiàn)High Five細(xì)胞可被諾達(dá)病毒（nodavirus）隱性感染，而且桿狀病毒感染High Five細(xì)胞可以刺激諾達(dá)病毒的病毒粒子的產(chǎn)生。 · High Five細(xì)胞系 Tn-368和High Five都是來(lái)源于粉紋夜蛾（Tn）的卵巢組織。重組蛋白表達(dá)方面，High Five細(xì)胞系表達(dá)量更高，表達(dá)某些蛋白時(shí)甚至是Sf-9細(xì)胞表達(dá)的20倍以上。High Five的糖基化和磷酸化修飾比Sf9更復(fù)雜，因此更適合表達(dá)一些分泌性重組蛋白。人乳頭瘤病毒的病毒樣顆粒疫苗就是在High Five細(xì)胞中產(chǎn)生的。High Five細(xì)胞系表達(dá)重組病毒性能優(yōu)越，經(jīng)常用于轉(zhuǎn)染和空斑純化。 與Sf細(xì)胞系相比，High Five細(xì)胞系從一開(kāi)始就顯示出優(yōu)越分泌糖蛋白生產(chǎn)的能力。 比較發(fā)現(xiàn)： 01、Sf9 細(xì)胞更適合于重組病毒擴(kuò)增及包裝；Sf21 因細(xì)胞直徑更大，更適用于病毒滴度空斑實(shí)驗(yàn)觀察；High five細(xì)胞更適用于分泌蛋白表達(dá)。 02、Sf9 細(xì)胞對(duì)滲透壓、剪切力和pH的耐受性比Sf21細(xì)胞更強(qiáng)，在轉(zhuǎn)染與生產(chǎn)高滴度桿狀病毒上表現(xiàn)出色。

03、High Five細(xì)胞比Sf9細(xì)胞增殖時(shí)間更短，表達(dá)量更高，其表達(dá)的蛋白在糖基化修飾方面比Sf9細(xì)胞更復(fù)雜。Sf9和High Five細(xì)胞具有懸浮和貼壁生長(zhǎng)的特性，因此能通過(guò)搖瓶和生物反應(yīng)器來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白。 Sf細(xì)胞系適用于懸浮培養(yǎng)，并且在沒(méi)有胰蛋白酶化的情況下通過(guò)適當(dāng)?shù)臄嚢韬苋菀讖呐囵B(yǎng)表面分離。Tn細(xì)胞系依賴于貼壁，但今天它們已經(jīng)很好地適應(yīng)了懸浮培養(yǎng)。Sf-21比Sf-9更脆弱，對(duì)滲透、pH和剪切應(yīng)力的耐受性不如Sf-9，并且生長(zhǎng)速率更低。如今，由于其生長(zhǎng)和感染特性，Sf-21的使用已經(jīng)減少。

High Five是一種昆蟲(chóng)細(xì)胞系，通常產(chǎn)生更多的重組蛋白，與Sf-9相比高出20倍。High Five細(xì)胞比Sf-9更能抵抗剪切應(yīng)力和攪拌。High Five細(xì)胞比Sf-9細(xì)胞更大，蛋白質(zhì)含量更高，其細(xì)胞大小分布比Sf-9細(xì)胞更廣。然而，細(xì)胞大小取決于介質(zhì)滲透壓、剪切應(yīng)力、細(xì)胞狀態(tài)（存活、凋亡等）。近年來(lái)，由SF-9細(xì)胞衍生的固有細(xì)胞系express SF+（SF+）的優(yōu)越特性促使其在幾種生物制品的生產(chǎn)中使用，例如流感疫苗FluBlok。