系統(tǒng)描繪轉(zhuǎn)錄起始連續(xù)動態(tài)全過程

復旦上醫(yī)徐彥輝團隊在《科學》（Science）雜志上在線發(fā)表題為“Structural visualization of transc[x]ription initiation in action”的研究長文（Research Article）。該項研究用結構重現(xiàn)出了轉(zhuǎn)錄從頭起始的16個連續(xù)動態(tài)全過程，揭示了通用轉(zhuǎn)錄因子(GTFs)和轉(zhuǎn)錄泡協(xié)同RNA聚合酶Pol II調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始向轉(zhuǎn)錄延伸轉(zhuǎn)變的分子機制。

一部58萬張照片的分子定格電影

生命的遺傳物質(zhì)是DNA，而DNA可以通過自我復制，伴隨著細胞的分裂傳遞遺傳信息。DNA可以通過轉(zhuǎn)錄形成RNA，RNA通過翻譯的過程合成蛋白質(zhì)。

轉(zhuǎn)錄是基因表達調(diào)控的核心，基因表達調(diào)控在人的發(fā)育、疾病發(fā)生過程中起到重要作用。真核細胞的基因轉(zhuǎn)錄需要經(jīng)歷起始，延伸，終止等多個階段。多細胞生物為了滿足在同一套基因組的基礎上實現(xiàn)差異性的基因表達，需要經(jīng)過非常復雜且精細的基因表達調(diào)控過程?；虮磉_調(diào)控主要集中發(fā)生在轉(zhuǎn)錄的起始階段，細胞中基因的轉(zhuǎn)錄默認是低活性狀態(tài)，需要經(jīng)歷一系列復雜的轉(zhuǎn)錄起始過程，才能起始基因表達。轉(zhuǎn)錄起始過程涉及十余個復合物上百個蛋白的巨大轉(zhuǎn)變，過去幾十年來，眾多的實驗室利用生物化學、單分子生物物理以及結構生物學等方法開展了大量探索性的工作，但對其發(fā)生過程和分子機制的理解還不夠深入。

在此項研究中，徐彥輝團隊解析了一個轉(zhuǎn)錄過程中重要的動態(tài)事件：從轉(zhuǎn)錄起始向轉(zhuǎn)錄延伸的過渡，這一事件也被稱為啟動子逃逸。啟動子逃逸是轉(zhuǎn)錄從起始到延伸的關鍵轉(zhuǎn)折步驟，在這一過程中RNA聚合酶II的構象需要發(fā)生變化，在生成RNA產(chǎn)物的同時解離通用轉(zhuǎn)錄因子。

長期以來，這一過程一直蒙著神秘面紗。中國科學院生物物理研究所研究員朱冰在專家點評中解讀，“這（揭示啟動子逃逸過程）是領域中一個長期未能解決的問題，因為這是一個快速的動態(tài)事件，RNA聚合酶II延伸的速度一般被認為是每分鐘幾千個堿基，而啟動子逃逸過程涉及的大約只有20個左右的堿基的合成，也就是說需要在幾秒鐘內(nèi)完成一系列的動態(tài)事件，這對于結構生物學研究是一個極大的挑戰(zhàn)?！?/span>

在研究過程中，徐彥輝團隊致力于將這一瞬間定格為永恒。據(jù)介紹，研究人員設計了一系列的轉(zhuǎn)錄模板，可以控制RNA聚合酶II停在轉(zhuǎn)錄17個堿基時的任意一個堿基位置。這一設計好比讓連貫的場景變成一楨楨定格畫面，隨后，研究人員逐步捕捉每一步的畫面，連貫而成一部動態(tài)“電影”。這部“電影”也首描繪出了連續(xù)的轉(zhuǎn)錄起始動態(tài)全過程，揭示完整轉(zhuǎn)錄起始過程及其分子機制。

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三個不同的方式展示同一個動態(tài)過程。其中左側(cè)為完整復合物，右上為隱去覆蓋核酸的部分蛋白質(zhì)以顯示催化中心和核酸相互作用關系，右下為核酸（黃色的為模板鏈）。

由于復合物的組成和構象不均一，為了獲得高分辨率結構數(shù)據(jù)，研究人員利用復旦上醫(yī)平臺300 kV 冷凍電鏡采集了約110天，共58萬張照片數(shù)據(jù)，獲得了分別暫停在轉(zhuǎn)錄起始位點下游2-17位核苷酸，核心分辨率為2.7-3.3 ?，共16個轉(zhuǎn)錄復合物（TC2-TC17）的結構。通過這16個連續(xù)的結構，結合早期該團隊解析的轉(zhuǎn)錄前起始復合物PIC結構，研究團隊得以描繪這一動態(tài)全過程。

通過動態(tài)全過程的描繪，研究團隊首觀測到啟動子逃逸的“關鍵一刻”正是當RNA鏈由9個核苷酸（nucleotide，nt）增加到10 nt時，NTP水解驅(qū)動RNA-DNA移位并推動所累積的模板單鏈脹破由TFIIB和Pol II形成的模板鏈通道，導致TFIIB連帶其他GTF從Pol II上解離，轉(zhuǎn)錄泡“崩塌”（bubble collapse），轉(zhuǎn)錄復合物由ITC轉(zhuǎn)變成EEC狀態(tài)，Pol II從啟動子逃逸（promoter escape）。生命設計這一分子層面的“過河拆橋”，其邏輯在于：為了避免異常的基因表達，真核基因默認是沉默狀態(tài)，Pol II本身無法打開啟動起始轉(zhuǎn)錄，為了起始轉(zhuǎn)錄，需要GTF幫助Pol II結合啟動子開始合成RNA，完成起始后當RNA-Pol II-DNA足夠穩(wěn)定， Pol II要進入延伸階段離開啟動子區(qū)域，需要擺脫GTF和啟動子的束縛。

“用復雜的完整的復合物去開展研究”

過去幾十年來，關于轉(zhuǎn)錄起始研究達數(shù)百篇，但由于實驗設計和實驗材料的不一致，不同的實驗結論之間相互矛盾，許多結論長期以來未得到統(tǒng)一。

本研究將眾多看似矛盾的結論作了統(tǒng)一，回答了起始過程中眾多問題，揭示了轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控的機制，為理解基因表達調(diào)控奠定了結構基礎。該研究也開創(chuàng)了利用生化和結構生物學重構生物大分子機器動態(tài)過程，揭示其工作機制的新路徑，為眾多復雜過程的研究提供了新思路。

此前，徐彥輝團隊連續(xù)在Science雜志發(fā)表5篇研究論文，揭示多個轉(zhuǎn)錄起始關鍵過程的分子機制，包括揭示人源BAF復合物的染色質(zhì)重塑機制（點此閱讀）、轉(zhuǎn)錄起始復合物識別基因啟動子及其動態(tài)裝配機制（點此閱讀）、中介體促進RNA聚合酶磷酸化和轉(zhuǎn)錄激活機制（點此閱讀）、+1核小體調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的分子機制（點此閱讀）以及發(fā)現(xiàn)并鑒定新型轉(zhuǎn)錄調(diào)控復合物INTAC（點此閱讀）。上述工作較為系統(tǒng)地揭示了轉(zhuǎn)錄起始各個階段關鍵點的復合物狀態(tài)，推動了對轉(zhuǎn)錄機制的深入理解。

“當我們想進入到這個領域的時候，我們也可以走簡單的路，但是我們希望從根本上去回答這個問題，用復雜的完整的復合物去開展研究。”徐彥輝表示?！拔覀兌际钦驹趲资晟徒Y構研究基礎上，才能得到現(xiàn)在的一些發(fā)現(xiàn)。當然，給大家傳遞的信息是我們對于生命的分子事件的理解還遠遠沒有達到真實的程度，還有很多未知的東西需要我們?nèi)ヌ剿??！蔽磥?，團隊將進一步探索更多轉(zhuǎn)錄過程的圖景。