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優(yōu)化堿基編輯，治療脊髓性肌萎縮癥

文章來源：健康界發(fā)布日期：2023-12-18瀏覽次數(shù)：30

脊髓性肌萎縮癥（SMA）是一種毀滅性的神經(jīng)肌肉疾病，是全球嬰兒死亡的重要原因。 S MA的主要特征是運動神經(jīng)元死亡、肌肉失神經(jīng)支配和肌肉無力。 大 多數(shù)SMA病例是由運動神經(jīng)元存活基因1（SMN1）的功能缺失突變引起的。 SMN1 中常見的突變是外顯子7的缺失，這導致SMN蛋白質(zhì)功能喪失。

SMA嚴重程度的一個重要影響因素是旁系同源基因SMN2的拷貝數(shù)。 SMN2 的序列與SMN1不同之處在于外顯子7中有一個同義的C·G-to-T·A轉(zhuǎn)換。 SMN2 的外顯子7的第6位核苷酸的C-to-T轉(zhuǎn)換（簡稱C6T） 導致大多數(shù)SMN2的mRNA中由于選擇性剪接而跳過外顯子7。 雖然SMN2仍然產(chǎn)生約10%的功能性SMN蛋白質(zhì)，但這不足以挽救絕大多數(shù)SMA患者 。
Risdiplam（靶向SMN2的小分子藥物）、Nusinersen（靶向SMN2的ASO藥物）和Onasemnogene Abeparvovec（AAV基因療法）是三種獲得FDA批準上市的SMA治療藥物，這些藥物已經(jīng)顯示出的患者益處，對患有SMA的新生兒的生活產(chǎn)生了重大影響。 盡管如此，這三種療法都存在一些問題，包括需要嚴格的劑量方案、存在 副作用，以及長期療效不佳。

該研究使用了基于SpCas9變體SpRY的腺嘌呤堿基編輯 器（ABE8e-SpRY），逆轉(zhuǎn)了 脊髓性肌萎縮癥（SMA） 細胞和小鼠模型的SMN2基因的外顯子7的C6T（即A-to-G編輯） ，從而恢復 SMN蛋 白水平，提高了小鼠模型的體重、運動能力和存活率。這些結(jié)果表明，使用堿基編輯或其他基于CRISPR 的基因編輯技術(shù)來靶向SMN2基因特定位點并恢復SMN蛋白水平，可能有助于SMA患者的治療。SMA 病例的主要原因是SMN1基因的功能缺失突變，但SMN1并不是參與者，SMN2基因的拷貝數(shù)是SMA嚴重程度的重要影響因素。 SMN2 基因的外顯子7的 第6位核苷酸的C-to-T轉(zhuǎn)換（簡稱C6T） 導致大多數(shù)SMN2的mRNA中由于選擇性剪接而跳過外顯子7，產(chǎn)生了無功能的SMN蛋白。因此，研究團隊嘗試使用堿基編輯技術(shù)直接編輯SMN2基因，來恢復SMN蛋白。
早在2020年，Benjamin Kleinstiver 團隊就在 Science 期刊發(fā)表論文，開發(fā)了一個SpCas9的變體 ——SpRY， 它不再需要依賴特定的PAM序列，因此能夠識別并編輯基因組上幾乎任何位點。
研究團隊開發(fā)了基于SpRY的腺嘌呤堿基編輯器 （ABE8e-SpRY） ，逆轉(zhuǎn)SMN2基因的外顯子7的C6T （即A-to-G編輯） 。他們將這一編輯策略應(yīng)用于從SMA患者身上提取的成纖維細胞，提高了 SMN2 的mRNA中外顯子7的保留，從而提高了SMN蛋白表達水平，而且沒有發(fā)現(xiàn)任何意外脫靶編輯。
然后，他們進一步使用雙載體腺相關(guān)病毒（AAV） ，將 gRNA和AB遞送到SMA小鼠模型體內(nèi) 。在主要感興趣的組織中，檢測到平均約6%（大腦）和約4%（脊髓）的A-to-G編輯 ，這能夠使SMN的轉(zhuǎn)錄水平增加2-4倍 。該研究還顯示，更長的隨訪時間會產(chǎn)生更高的堿基編輯水平。此外，與僅通過腦室內(nèi)注射相比，額外的靜脈注射能夠增加對肝臟和心臟組織中堿基編輯，而且，隨著時間的推移，這些治療的小 鼠模型的體重、運動功能以及生存了都有了明顯改善，這 說明了外周SMN蛋白的恢復對于SMA小鼠的表型恢復至關(guān)重要，可以增強其表型恢復

所有這些實驗結(jié)果表明，堿基編輯介導的對SMN2基因的外顯子7的C6T的精編輯，能夠增加功能性SMN蛋白水平，從而為治療SMA提供了一種新的治療策略。從更廣泛的意義上說，這項工作證明了可以使用SpRY等適應(yīng)性強的CRISPR核酸酶對基因進行精確修飾，這為使用這種方法治療其他疾病打開了新大門。