納米抗體在小分子化合物檢測(cè)的應(yīng)用

人們?cè)谥劓溈贵w可變區(qū)片段（variable domain of the heavy chain of heavy- chain antibody， VHH） 基礎(chǔ)上開發(fā)了一種僅由重鏈可變區(qū)構(gòu)成的單域抗體（single domain antibody， sdAb），長(zhǎng)4 nm，直徑2.5 nm，分子量為12–15 kDa，是目前已知小的活性抗原結(jié)合蛋白，僅為傳統(tǒng)抗體大小的十分之一，也被稱為納米抗體（nanobody，Nb），其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和優(yōu)越的特性使其成為多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

納米抗體在環(huán)境污染物、生物毒素等小分子化合物的檢測(cè)中不僅降低了檢測(cè)下限，提高了靈敏度和精確度，而且通過(guò)優(yōu)化測(cè)定過(guò)程，能夠?qū)崿F(xiàn)快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)，推動(dòng)免疫檢測(cè)方法和傳感技術(shù)的快速發(fā)展，納米抗體（nanobody，Nb）在競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法、免疫PCR、熒光偏振免疫分析和橫流免疫分析等免疫檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)中取得了許多積極成果。

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)Liu等用半抗原CBR1與鑰孔血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin， KLH） 偶聯(lián)，將CBR1-KLH進(jìn)行皮下免疫羊駝，然后經(jīng)提取總RNA、PCR擴(kuò)增VHH片段、酶切、轉(zhuǎn)化等步驟后成功構(gòu)建VHH庫(kù)，構(gòu)建的文庫(kù)大小約為1×108 CFU/mL，經(jīng)過(guò)洗脫、淘選、純化等一系列過(guò)程后制備了甲萘威特異性VHHs，開發(fā)了基于納米抗體（nanobody，Nb）的免疫測(cè)定方法檢測(cè)谷物中的廣譜氨基甲酸酯類殺蟲劑甲萘威（carbaryl），且在谷物樣品中的可重復(fù)性和再現(xiàn)性良好?；诩{米抗體（nanobody， Nb）的小分子檢測(cè)在這項(xiàng)研究中具有一定的基礎(chǔ)應(yīng)用。

納米抗體（nanobody， Nb）在農(nóng)藥獸藥殘留以及重金屬檢測(cè)中表現(xiàn)出較高的應(yīng)用價(jià)值。Li等研究發(fā)現(xiàn)納米抗體-堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP） 對(duì)除草劑2, 4-二氯苯氧基乙酸（2, 4-d） 表現(xiàn)出優(yōu)異的敏感性和特異性（IC50=29.2 ng/mL），2, 4-d深埋在CDR3和CDR2形成的袋中，NB3-9的結(jié)合袋通過(guò)氫鍵和疏水力與2, 4-d的相互作用，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了以納米抗體-堿性磷酸酶（AP） 融合為基礎(chǔ)的2, 4-d一步熒光酶免疫測(cè)定法（one-step fluorescent enzyme immunoassay， FLEIA），通過(guò)分析比較確定了FLEIA法可作為一種監(jiān)測(cè)環(huán)境中2, 4-d殘留的便捷工具。3-苯氧基苯甲酸（3-PBA） 被廣泛用作人類擬除蟲菊酯類殺蟲劑暴露的常見生物標(biāo)志物，近期El-Moghazy等研制了一種基于納米抗體的新型電化學(xué)競(jìng)爭(zhēng)免疫傳感器用于3-PBA的快速檢測(cè)，檢測(cè)限為0.64 pg/mL，檢測(cè)限遠(yuǎn)低于膠體金/單克隆抗體/側(cè)向流動(dòng)免疫分析方法，LOD為130 ng/mL。

納米抗體（nanobody， Nb）在檢測(cè)食品和環(huán)境真菌毒素方面展現(xiàn)了強(qiáng)大的應(yīng)用前景。Wang等開發(fā)并優(yōu)化了PO8-VHH的納米抗體-多克隆抗體夾心ELISA法測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品中的曲霉病菌，能夠達(dá)到1 μg/mL濃度的檢測(cè)效果，進(jìn)而監(jiān)測(cè)農(nóng)產(chǎn)品曲霉污染。Tang等使用OTA和抗OTA Nb分別與兩種尺寸的高效熒光標(biāo)簽-量子點(diǎn)（quantum dot， QD） 共價(jià)耦合，制備了OTA標(biāo)記的GQD結(jié)合物（OTA-GQD） 和Nb28標(biāo)記的RQD偶聯(lián)物（Nb-RQD） 分別作為能量供體和受體，如下圖所示，開發(fā)出一種Nb-FRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移） 免疫傳感器用于檢測(cè)谷物樣品中赭曲霉毒素A （ochratoxin， OTA），易于表達(dá)、小尺寸的Nbs可以縮短兩個(gè)QD之間的有效距離，從而提高檢測(cè)靈敏度，單步測(cè)定可以在5 min內(nèi)完成，檢測(cè)限為5 pg/mL。

納米抗體的獲得主要通過(guò)免疫羊駝?dòng)裳蝰勼w內(nèi)自身的抗體成熟階段來(lái)得到抗體基因，然后通過(guò)噬菌體展示篩選技術(shù)來(lái)從羊駝抗體庫(kù)中篩選得到適合的抗體序列。整個(gè)流程主要包括羊駝免疫、噬菌體文庫(kù)構(gòu)建和抗體篩選三個(gè)階段。