抗體酵母展示系統(tǒng)
文章來源：健康界發(fā)布日期：2022-08-05瀏覽次數(shù)：142 抗體展示技術(shù)使成功分離具有治療潛力的抗原特異性抗體成為可能。其中，噬菌體展示系統(tǒng)是成熟的系統(tǒng)，目前已有十幾種通過噬菌體展示技術(shù)獲得的治療性抗體獲批上市。近年來，其他幾項(xiàng)技術(shù)也達(dá)到了一定的成熟程度，其中比較引人注目的是酵母展示系統(tǒng)。與其他展示系統(tǒng)相比，酵母展示系統(tǒng)作為真核展示系統(tǒng)的主要優(yōu)勢(shì)是其高效的翻譯后修飾機(jī)制和更好的適應(yīng)于合成具有多個(gè)二硫鍵的復(fù)雜哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)。酵母展示系統(tǒng)促成了PD-1阻斷抗體分子Sintilimab的產(chǎn)生，該分子已在中國獲得上市批準(zhǔn)，用于治療難治性經(jīng)典霍奇金淋巴瘤等適應(yīng)癥。
酵母展示系統(tǒng)技術(shù)是由Boder和Wittrup于1997年的。外源蛋白通過與酵母細(xì)胞壁蛋白的融合，在酵母表面展示。酵母含有200nM厚的細(xì)胞壁，由β-多糖、甘露糖蛋白和殼多糖組成。酵母細(xì)胞壁的內(nèi)表面，通過形成緊密的殼多糖連接的β-1，3-葡聚糖微纖維的骨架層來阻止大分子的滲透。外表面由更易溶的分支β-1，6-葡聚糖和甘露糖蛋白組成。在大多數(shù)酵母展示系統(tǒng)中，展示在外細(xì)胞壁上的大多數(shù)異源蛋白通過 GPI（糖基磷脂酰肌醇）在其 C 端共價(jià)連接到 β-1,6-葡聚糖上。GPI錨定蛋白通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到酵母細(xì)胞表面，并與細(xì)胞壁甘露糖蛋白層形成β-1，6-葡聚糖橋。
雖然不同的酵母菌株被用來展示各種蛋白質(zhì)和多肽，但基于釀酒酵母Aga1-Aga2的酵母展示系統(tǒng)是受歡迎的系統(tǒng)，它具有109庫容量。這種方法的原理是基于融合到Aga2蛋白上的外源蛋白的表達(dá)。Aga2蛋白本身通過兩個(gè)二硫鍵與Aga1蛋白錨定在細(xì)胞膜上，從而在酵母表面形成一個(gè)共價(jià)復(fù)合體。外源蛋白和多肽可以與Aga2的N-端或C-端融合。利用該系統(tǒng)，僅在一個(gè)酵母細(xì)胞的表面就可以展示超過3×104個(gè)異源蛋白質(zhì)分子。EBY100作為一株釀酒酵母工程菌株，可應(yīng)用于Aga1-Aga2酵母展示系統(tǒng)。
構(gòu)建酵母展示抗體庫的基礎(chǔ)是將異源免疫球蛋白基因庫克隆到酵母展示載體中，并將克隆的基因與Aga2p蛋白融合表達(dá)。酵母展示系統(tǒng)中使用的大多數(shù)抗體形式是單鏈抗體；然而，其他抗體形式包括Fabs、nanobody和完整的IgG1也可以在酵母表面展示。在酵母展示載體中插入抗體編碼基因會(huì)產(chǎn)生107到109的文庫。 通常，抗體片段與Aga2p蛋白的C末端結(jié)合，但nanobody結(jié)構(gòu)除外。Nanobody從其C-末端融合到Aga2p的N-末端。這種融合導(dǎo)致完全暴露的CDR用于抗原結(jié)合。正交酰基載體蛋白(ACP)標(biāo)簽用于熒光團(tuán)(或生物素)的共價(jià)連接，它允許監(jiān)測酵母表面表達(dá)的nanobody的展示水平。
在從酵母展示系統(tǒng)中分離抗體的過程中，使用了磁性激活細(xì)胞分選(MACS)和流式細(xì)胞儀(FACS)(圖3)。為了消除流式細(xì)胞儀檢測速率的限制，增加流式細(xì)胞儀的選擇性，非結(jié)合性單抗片段被MACS清除。用MACS系統(tǒng)選擇的酵母細(xì)胞用c-Myc Tag標(biāo)記可用于檢測ScFv或Fab的表達(dá)。
酵母展示系統(tǒng)在抗體工程中的主要應(yīng)用之一是親和力成熟。與噬菌體展示系統(tǒng)類似，可以利用不同的隨機(jī)化策略來實(shí)現(xiàn)，例如CDR靶向突變；酵母展示系統(tǒng)也可用于抗體人源化。此外，與噬菌體展示系統(tǒng)一樣，酵母展示系統(tǒng)已被證明可用于設(shè)計(jì)下一代抗體，如pH依賴性抗體。 與噬菌體和細(xì)菌的展示系統(tǒng)相比，酵母展示系統(tǒng)具有多重優(yōu)勢(shì)。酵母作為一種單細(xì)胞有機(jī)體，依賴于真核表達(dá)機(jī)制，可以翻譯后修飾來表達(dá)和折疊復(fù)雜的真核蛋白。在酵母表面錨定蛋白的C端或N端插入異源蛋白不會(huì)破壞表面蛋白的結(jié)構(gòu)，也不會(huì)影響表面展示的效率。在酵母展示中，整個(gè)抗體的溶解性得到了改善。
此外，伴侶蛋白的存在有助于酵母ER中蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確折疊。酵母細(xì)胞在FACS中的分選親和性為其生物物理特性和大分子組合表面展示文庫的高通量篩選提供了良好的基礎(chǔ)。此外，用FACS對(duì)單個(gè)變異體進(jìn)行定量和生物物理表征是可行的，而不需要亞克隆、可溶性表達(dá)和純化。然而，酵母展示系統(tǒng)也有一些局限性。第一個(gè)限制是其較小的庫容量，比基于噬菌體和細(xì)菌的展示系統(tǒng)獲得的庫容量低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。另外，在酵母展示系統(tǒng)中，由于酵母表面存在多個(gè)蛋白質(zhì)拷貝，可能會(huì)發(fā)生與寡聚蛋白靶標(biāo)不希望的多價(jià)結(jié)合。
總結(jié)
抗體展示技術(shù)開啟了抗體生成的新紀(jì)元，使人們能夠從組合庫中發(fā)現(xiàn)高親和力和高活性的抗體。在過去的幾十年里，噬菌體展示技術(shù)成為一種領(lǐng)先的展示方法，產(chǎn)生了十幾種已被批準(zhǔn)上市的抗體。噬菌體展示技術(shù)的成功刺激了其他展示方法的使用。酵母作為真核宿主生物用于展示比基于噬菌體展示系統(tǒng)可能更有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗赡馨ǚg后修飾。在酵母展示中，定量的高通量FACS篩選和高效的折疊緩解了親和力問題和小文庫的多樣性。毫無疑問，酵母展示技術(shù)在治療、研究和診斷領(lǐng)域中將繼續(xù)改進(jìn)，并在未來幾十年發(fā)揮作用。
