腸道微生物與肝膽腫瘤抗PD-1免疫治療臨床反應(yīng)相關(guān)

背景：腸道微生物與不同類型癌癥的免疫治療反應(yīng)有關(guān)。然而，腸道微生物對(duì)肝膽腫瘤免疫治療的影響仍不清楚。本研究旨在探討晚期肝膽腫瘤患者腸道微生物與抗PD-1免疫治療臨床反應(yīng)的關(guān)系。

方法：從一線化療進(jìn)展到不能切除的肝細(xì)胞癌或晚期膽道癌患者被納入研究。在抗PD-1治療前和治療期間收集糞便樣本，并通過宏基因組測(cè)序進(jìn)行分析。鑒別出差異富集類群和預(yù)后相關(guān)類群。進(jìn)一步利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)和me[x]taCyc數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異富集類群進(jìn)行注釋，探討腸道微生物群影響腫瘤免疫治療的潛在機(jī)制。

結(jié)果：本研究共納入65例接受抗PD-1治療的晚期肝膽腫瘤患者。74個(gè)分類群在臨床獲益組(CBR)富集，40個(gè)分類群在非臨床獲益組(NCB)富集。在這些分類群中，Lachnospiraceae bacterium-GAM79和Alistipes sp Marseille-P5997豐度較高的患者(在CBR組中富集)比豐度較低的患者獲得更長(zhǎng)的無進(jìn)展生存期(PFS)和總生存期(OS)。在PFS較長(zhǎng)的患者中，CBR組富集的Ruminococcus calidus和Erysipelotichaceae bacterium-GAM147的豐度也較高。相反，Veillonellaceae豐度較高的患者PFS和OS較短，而NCB組中Veillonellaceae富集。

功能注釋表明，CBR組的富集類群與能量代謝相關(guān)，而NCB組的富集類群與氨基酸代謝相關(guān)，這可能調(diào)節(jié)肝膽腫瘤免疫治療的臨床反應(yīng)。此外，免疫治療相關(guān)的不良反應(yīng)也受到腸道微生物多樣性和相對(duì)豐度的影響。

結(jié)論： 本研究證明腸道微生物群與肝膽腫瘤患者抗PD-1免疫治療的臨床反應(yīng)相關(guān)。響應(yīng)者的分類特征是預(yù)測(cè)免疫治療的臨床反應(yīng)和生存獲益的有效生物標(biāo)志物，這可能為調(diào)節(jié)腫瘤免疫治療反應(yīng)提供新的治療靶點(diǎn)。    

結(jié)果

1 患者特征

從2018年11月至2020年12月，共納入162例晚期肝膽腫瘤患者，納入65例患者(圖1)?；颊呋€特征總結(jié)見表1。該研究包括30例HCC和35例BTC患者。所有患者均接受抗PD-1免疫治療。按照RECIST V.1.1標(biāo)準(zhǔn)，PR(部分緩解)、SD(疾病穩(wěn)定)、PD(疾病進(jìn)展)分別有20例、28例、17例患者。

在CBR評(píng)估中，32例患者為CBR，33例患者為NCB。大約一半的患者有肝炎史，并在PD-1單抗藥物治療期間接受抗病毒預(yù)防治療。所有患者肝功能及體能狀態(tài)均良好；三分之一的患者膽汁酸升高。CBR組與NCB組在性別、年齡、肝炎史、膽紅素、膽汁酸、腫瘤數(shù)量、腫瘤大小、腫瘤分期等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。收集65例患者的基線糞便樣本，8例患者(4例CBR和4例NCB)的持續(xù)動(dòng)態(tài)樣本。

BTC，膽道癌；CBR，臨床獲益；ECOG-PS，美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組體能狀態(tài)評(píng)分；HCC，肝細(xì)胞癌；NCB，非臨床獲益。   

2 腸道微生物組成與抗PD-1免疫治療的不同臨床反應(yīng)相關(guān)

為了探討腸道微生物組成與免疫治療反應(yīng)之間的關(guān)系，我們比較了CBR組和NCB組在不同系統(tǒng)發(fā)育水平上的相對(duì)豐度?？傮w而言，在門水平上，擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)在CBR組和NCB組的腸道微生物群落中均占主導(dǎo)地位，其次是放線菌門(Actinobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)(在線補(bǔ)充圖S1)。CBR組的Bacteroidetes豐度更高(p=0.028)，NCB組的Proteobacteria豐度更高(p=0.067)。在目水平上觀察到類似的組合模式。

CBR組中Bacteroidales(屬于擬桿菌門)的相對(duì)豐度較高(p=0.028)，而NCB組中Enterobacterales(屬于變形菌門)的相對(duì)豐度更高(p=0.061)(圖2B)。Veillonellales主要在NCB組中發(fā)現(xiàn)(圖2A)，其相對(duì)豐度在CBR組中降低(p<0.001)(圖2B)。豐富的前20種物種主要屬于擬桿菌門(在線補(bǔ)充圖S2)，其中Alistipes sp Marseille-P5997、Bacteroides fluxus和Bacteroides zoogleoformans主要在CBR組中富集(p=0.024，p=0.012和p=0.031)(在線補(bǔ)充表S1)。

在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異屬或種中，CBR組富集的細(xì)菌類群大多屬于擬桿菌門和厚壁菌門，而NCB組富集的細(xì)菌類群大多屬于變形菌門(在線補(bǔ)充圖S3和S4)。值得注意的是，Lachnospiraceae bacterium-GAM79和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)的幾個(gè)分類群(Ruminococcus callidus、Eubacterium siraeum、Gemmiger formicilis和Faecalibacterium)在CBR組中富集。此外，對(duì)8例患者的動(dòng)態(tài)糞便樣本進(jìn)行宏基因組分析發(fā)現(xiàn)，CBR組的腸道微生物組成在門水平上隨治療保持相對(duì)穩(wěn)定，與65例患者的腸道微生物組成相似。而NCB組的微生物多樣性似乎有所下降。

總之，基線腸道微生物多樣性與肝膽腫瘤患者抗PD-1治療的良好反應(yīng)相關(guān)，這支持腸道微生物可能是預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)的有效生物標(biāo)志物。

3 差異富集的細(xì)菌類群與ICI治療的生存獲益相關(guān) 

系統(tǒng)發(fā)育多樣性方面，α多樣性(包括Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Pielou指數(shù)和Chao1指數(shù))在CBR組和NCB組之間沒有差異(在線補(bǔ)充)。然而，基于Bray-Curtis距離評(píng)估的β多樣性，PCoA圖顯示CBR組患者與NCB組患者明顯分離。在種水平上，CBR組和NCB組共有1738種常見物種，分別有504和575種特有種。

通過LEfSe分析進(jìn)一步確定74個(gè)CBR組富集類群和40個(gè)NCB組富集類群可能影響ICI治療的臨床反應(yīng)(LDA＞2，p＜0.05)(在線補(bǔ)充)。值得注意的是，擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、擬桿菌目(Bacteroidales)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)是CBR組中的高富集類群，而Negativicutes、韋榮球菌目(Veillonellales)和韋榮球菌科(Veillonellaceae)是NCB組中的高富集類群(LDA＞3，p＜0.05)。

在HCC或BTC患者的亞組分析中觀察到類似的差異富集模式。HCC患者和BTC患者間微生物α多樣性和β多樣性沒有差異(在線補(bǔ)充)。兩種癌癥類型之間存在差異的細(xì)菌類群主要屬于擬桿菌門(在線補(bǔ)充)，BTC患者的擬桿菌門豐度高于HCC患者(LDA＞3，p＜0.05)(在線補(bǔ)充)，BTC患者的CBR組中也富集擬桿菌門(在線補(bǔ)充圖S9A，B)。對(duì)于HCC患者，NCB組也觀察到韋榮球菌科(厚壁菌門)的豐度更高(LDA＞3，p＜0.05)(在線補(bǔ)充)。

為了進(jìn)一步探索與生存期相關(guān)的微生物類群，基于CBR組和NCB組中這些差異富集類群的平均豐度，我們將65例肝膽腫瘤患者分為高豐度組和低豐度組。生存分析顯示，Lachnospiraceae bacterium-GAM79豐度較高的患者比豐度較低的患者具有更長(zhǎng)的PFS(mPFS:7.9個(gè)月vs 5.1個(gè)月，p=0.020)和OS(mOS:NRvs 13.8個(gè)月，p=0.023)。Lachnospiraceae bacterium-GAM79和Ruminococcus callidus的富集也與更長(zhǎng)的PFS相關(guān)(mPFS:10.8個(gè)月vs 4.9個(gè)月，p=0.009；mPFS:22.1個(gè)月vs 5.5個(gè)月，p=0.006)(在線補(bǔ)充)?？紤]到豐富的類群，擬桿菌門(Bacteroidetes)，盡管只有較高豐度的擬桿菌目顯示出與良好預(yù)后相關(guān)的趨勢(shì)(mPFS:6.9個(gè)月vs 5.1個(gè)月，p=0.250；mOS:32.2個(gè)月vs 13.8個(gè)月，p=0.269)(在線補(bǔ)充D)，Alistipes sp. marseile-p5997豐度較高的患者PFS(mPFS: 9.0個(gè)月vs 5.2個(gè)月，p=0.013)和OS(mOS:NR vs 13.8個(gè)月，p=0.021)延長(zhǎng)，而Bacteroides zoogleoformans的富集也與較長(zhǎng)的PFS呈正相關(guān)(mPFS:8.1個(gè)月vs 5.2個(gè)月，p=0.043)(在線補(bǔ)充)。