宏基因組學(xué)支持的微生物監(jiān)測(cè)

病原體監(jiān)測(cè)策略的目標(biāo)各不相同，從確定物種和菌株到檢測(cè)抗生素耐藥基因或質(zhì)粒。從這個(gè)角度來(lái)看，我們關(guān)注宏基因組學(xué)在改善公共衛(wèi)生決策病原體監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用潛力。這與臨床診斷的宏基因組學(xué)不同，后者的主要目的是為了臨床管理，確定個(gè)體(或多個(gè))樣本中是否存在致病病原體。公共衛(wèi)生病原體監(jiān)測(cè)通常在醫(yī)院、凈水廠和農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行，并特別應(yīng)用于被認(rèn)為可能是緊急疾病來(lái)源的地點(diǎn)。公共衛(wèi)生病原體監(jiān)測(cè)的總體目標(biāo)是監(jiān)測(cè)已知和尚未出現(xiàn)的病原體，推動(dòng)早期風(fēng)險(xiǎn)緩解方案，以保護(hù)人類和動(dòng)物健康。

2 公共衛(wèi)生的傳統(tǒng)病原體監(jiān)測(cè)

現(xiàn)有的公共衛(wèi)生病原體監(jiān)測(cè)方法包括基于綜合征的感染事件監(jiān)測(cè)、對(duì)特定病原體(例如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)的主動(dòng)監(jiān)測(cè)以及基于實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)測(cè)。大多數(shù)以實(shí)驗(yàn)室為基礎(chǔ)的監(jiān)測(cè)工作側(cè)重于監(jiān)測(cè)臨床相關(guān)特征，如培養(yǎng)分離株中的抗菌素耐藥性(AMR)和致病血清型。此外，醫(yī)院的特定房間或病房，例如強(qiáng)化護(hù)理病房，經(jīng)常使用基于培養(yǎng)的方法對(duì)預(yù)先確定的病原體清單進(jìn)行調(diào)查。如果在疫情調(diào)查中涉及到環(huán)境污染物的流行病學(xué)問(wèn)題，則建議對(duì)空氣、水和表面進(jìn)行有針對(duì)性的采樣，以確定潛在來(lái)源。從疫情調(diào)查中培養(yǎng)的分離株通常采用各種分型方案(如多位點(diǎn)序列分型(MLST))，以確定疾病傳播。因此，需要各種各樣的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)、設(shè)備、試劑和相關(guān)的專業(yè)技能來(lái)對(duì)醫(yī)院中已知的人類病原體子集進(jìn)行監(jiān)測(cè)。社區(qū)病原體監(jiān)測(cè)主要在醫(yī)院、凈水廠和農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行，并使用多種策略。這些常規(guī)方法總結(jié)如下。

2.1 預(yù)防和管理暴發(fā)

公共衛(wèi)生和定點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)參與疾病通報(bào)、監(jiān)測(cè)已知人類病原體和檢測(cè)患者樣本中的病原體來(lái)支持傳染病監(jiān)測(cè)和疫情調(diào)查(表1)。除了通過(guò)培養(yǎng)和分子檢測(cè)進(jìn)行病原體鑒定外，監(jiān)測(cè)還可包括使用不同的分析方法進(jìn)行菌株分型，例如腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的血清分型、金黃色葡萄球菌的MLST和抗生素耐藥性檢測(cè)。傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)方案通常需要廣泛的實(shí)驗(yàn)室能力和分析(圖1)，這使得在地方或國(guó)家層面整合信息具有挑戰(zhàn)性，更不用說(shuō)在全球范圍內(nèi)，盡管試圖標(biāo)準(zhǔn)化流程(如WHO/CDS/CSR/ISR/99.2)。此外，血清分型等技術(shù)需要對(duì)活的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行操作，其中一些會(huì)造成實(shí)驗(yàn)室獲得性感染(LAI)的重大風(fēng)險(xiǎn)，例如腦膜炎奈瑟菌或傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella enterica)血清型。使用全基因組測(cè)序(WGS)對(duì)細(xì)菌、病毒以及在一定程度上對(duì)真菌進(jìn)行檢測(cè)正在獲得越來(lái)越多的關(guān)注，但尚未成為大多數(shù)定點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)。雖然WGS非常適合這一目的，但前期資源和人力資本要求一直是采用該體系的障礙，特別是在低收入和中等收入國(guó)家。

2.2 食品和水安全

傳統(tǒng)的食品微生物安全監(jiān)測(cè)依賴于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及隨后有針對(duì)性地檢測(cè)食品中的病原體和衛(wèi)生或安全指示生物。從復(fù)雜的食物基質(zhì)中富集和選擇特定物種需要多種培養(yǎng)方法(表1)。對(duì)食源性AMR的監(jiān)測(cè)基于對(duì)選定的食源性致病菌的敏感性測(cè)試。對(duì)于飲用水，微生物污染的監(jiān)測(cè)也同樣基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。雖然廣泛采用了對(duì)指示性細(xì)菌生物(例如大腸桿菌)的監(jiān)測(cè)，但對(duì)水傳播病毒和原生動(dòng)物病原體的監(jiān)測(cè)并未得到一致解決。自2010年代初以來(lái)，WGS也已在高收入國(guó)家有效部署，以追蹤食源性病原體來(lái)調(diào)查疫情。值得注意的是，盡管低收入國(guó)家的食源性疾病負(fù)擔(dān)高，但這些國(guó)家往往缺乏采用WGS來(lái)緩解疫情的資源。

顯示了感興趣的病原體和特定應(yīng)用要求的選定示例。 ELISA，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定； MAST，多抗原序列分型； MLVA，多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析； NAATs，核酸擴(kuò)增檢測(cè)； PFGE，脈沖場(chǎng)凝膠電泳； RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)。 a 通常涉及基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)鑒定、生化測(cè)試、抗菌藥物敏感性檢測(cè)和通過(guò)乳膠凝集等方法進(jìn)行的血清分型。

2.3 人-動(dòng)物-生態(tài)系統(tǒng)界面

牲畜與各種人畜共患傳染病暴發(fā)有關(guān)，包括由禽流感、豬流感和尼帕病毒引起的暴發(fā)。隨著畜牧業(yè)的集約化，監(jiān)測(cè)可能會(huì)在我們防范流行病和大流行病方面發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。監(jiān)測(cè)人畜共患疾病需要人類衛(wèi)生、動(dòng)物衛(wèi)生和農(nóng)業(yè)部門(mén)就疾病趨勢(shì)進(jìn)行有效溝通，并參與對(duì)人類、動(dòng)物(野生動(dòng)物、牲畜和寵物)、環(huán)境(土壤和水)、媒介和食物來(lái)源樣本的協(xié)作檢測(cè)。例如，人畜共患的甲型流感病毒、在家禽和野生鳥(niǎo)類中流行的高致病性禽流感病毒株H5N1，是重點(diǎn)病原體。全球流感監(jiān)測(cè)和應(yīng)對(duì)系統(tǒng)(GISRS)支持對(duì)世界各地人類臨床樣本中流感的檢測(cè)和全基因組表征，這些數(shù)據(jù)由世界衛(wèi)生組織(WHO)進(jìn)行整合以監(jiān)測(cè)流感活動(dòng)并指導(dǎo)疫苗研發(fā)。對(duì)于動(dòng)物流感病毒，全球主要?jiǎng)游锛膊☆A(yù)警系統(tǒng)(GLEWS)結(jié)合并協(xié)調(diào)WHO、聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)的預(yù)警機(jī)制，以監(jiān)測(cè)野生動(dòng)物、牲畜、家禽和環(huán)境。然而，在大多數(shù)國(guó)家，覆蓋范圍仍然不確定，而且沒(méi)有足夠的資源(表1)。正在進(jìn)行的新型冠狀病毒(COVID-19)大流行進(jìn)一步突顯了人畜共患病和新發(fā)疾病構(gòu)成的公共衛(wèi)生威脅，據(jù)報(bào)道被反向人畜共患病感染的動(dòng)物種類越來(lái)越多，證明了跨物種傳播的低障礙。

2.4 社區(qū)衛(wèi)生

監(jiān)測(cè)廢水(污水)處理系統(tǒng)經(jīng)常被認(rèn)為是評(píng)估社區(qū)健康的一種有前景的方法，并已在埃及、印度、以色列、巴基斯坦、阿富汗和尼日利亞等多個(gè)國(guó)家的脊髓灰質(zhì)炎計(jì)劃中得到采用(表1)。COVID-19大流行加速了改善樣本處理和檢測(cè)靈敏度的研究，并有助于進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)廢水監(jiān)測(cè)在發(fā)現(xiàn)和阻斷暴發(fā)集群方面的有效性(圖1)。然而，從廢水中分離病毒需要專門(mén)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和專業(yè)人員。對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)病原體，例如嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)，對(duì)超出常規(guī)臨床診斷范圍的樣本進(jìn)行操作需要生物安全3級(jí)控制，只有資源充足且擁有高技能人員的研究中心才能做到這一點(diǎn)。

現(xiàn)有的基于實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)測(cè)工作側(cè)重于監(jiān)測(cè)培養(yǎng)分離株的特征，如AMR、血清型和毒力因子。通常，培養(yǎng)步驟之后是各種分型和表型分析，需要專門(mén)的設(shè)備和技術(shù)以及大量的時(shí)間和資源。獲得純分離物所需的時(shí)間根據(jù)每個(gè)物種的生長(zhǎng)速度而有所不同(兩天到幾周)，并根據(jù)每個(gè)部門(mén)和物種的具體要求，對(duì)所得分離物進(jìn)行下游表型和分子分析。BSL-3，生物安全三級(jí)。

2.5 醫(yī)療相關(guān)感染

除了對(duì)臨床相關(guān)的細(xì)菌和真菌分離物進(jìn)行監(jiān)測(cè)外，還對(duì)醫(yī)療衛(wèi)生環(huán)境(特別是空氣和水)進(jìn)行定期采樣，以檢查病原體和其他微生物污染(圖1)。例如，在強(qiáng)化護(hù)理病房，定期培養(yǎng)軍團(tuán)菌屬(Legionella)物種的飲用水，并監(jiān)測(cè)用于血液透析的水的活細(xì)胞總數(shù)和內(nèi)毒素水平。一些醫(yī)療指南主張，如果所用的水與強(qiáng)化護(hù)理病房中的患者直接接觸，則應(yīng)對(duì)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。醫(yī)療機(jī)構(gòu)用水的常規(guī)監(jiān)測(cè)可能對(duì)技術(shù)要求很高，需要各種培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件以及專業(yè)人員(表1)。

2.6 AMR監(jiān)測(cè)

全球抗菌素耐藥性監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(GLASS)網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)了AMR監(jiān)測(cè)，并使世界各地參與國(guó)能夠收集、綜合分析和共享標(biāo)準(zhǔn)化的人類細(xì)菌病原體AMR數(shù)據(jù)。當(dāng)前狀態(tài)下的AMR監(jiān)測(cè)依賴于目標(biāo)病原體的成功培養(yǎng)和分離(表1)。然后對(duì)培養(yǎng)分離物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的抗菌藥敏試驗(yàn)，以檢測(cè)預(yù)先確定的抗生素組。存在于食物鏈、農(nóng)作物、動(dòng)物和環(huán)境中的AMR可以通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到人和動(dòng)物的細(xì)菌病原體中，從而影響人和動(dòng)物的健康。然而，這些非醫(yī)療保健領(lǐng)域的AMR監(jiān)測(cè)還不夠完善和標(biāo)準(zhǔn)化。

2.7 整合病原體監(jiān)測(cè)

當(dāng)前的綜合監(jiān)測(cè)舉措，包括指南、實(shí)驗(yàn)室方法、數(shù)據(jù)收集和分析，仍然被“同一健康”部門(mén)(如人類健康、動(dòng)物健康和植物健康)分開(kāi)。鑒于樣品類型和目標(biāo)微生物種類的多樣性，需要一系列的處理和培養(yǎng)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的回收和分離。由于在培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)已知的人類病原體進(jìn)行了優(yōu)先排序和選擇，因此可能不會(huì)檢測(cè)到任何新的、新出現(xiàn)的或非典型病原體及其相關(guān)的AMR決定因素?？傮w費(fèi)用、缺乏一致的工作流程和結(jié)果、許多檢測(cè)的靶向性(只能找到所尋找的物質(zhì))以及缺乏偏頗較小的成本效益方案仍然是成功的主要障礙。相應(yīng)地，病原體監(jiān)測(cè)，特別是對(duì)醫(yī)療保健部門(mén)以外的監(jiān)測(cè)資源仍然不足，多重檢測(cè)的復(fù)雜性和要求可能會(huì)導(dǎo)致病原體監(jiān)測(cè)總體欠佳。

價(jià)格低廉的高通量測(cè)序技術(shù)的可用性為開(kāi)發(fā)新一代病原體監(jiān)測(cè)方法鋪平了道路。宏基因組學(xué)對(duì)包含多個(gè)物種的樣本的遺傳物質(zhì)進(jìn)行研究，可以使檢測(cè)已知和未知病毒、細(xì)菌和真菌的無(wú)需培養(yǎng)的方法和工作流程成為可能。宏基因組研究通常使用基于標(biāo)記基因的靶向擴(kuò)增子方法(例如，16S rRNA基因測(cè)序)或鳥(niǎo)槍法宏基因組測(cè)序來(lái)探測(cè)樣本的整個(gè)遺傳內(nèi)容。樣本的宏基因組測(cè)序還可以檢測(cè)其基因組范圍之外的毒力和耐藥性決定因素。隨著分析的簡(jiǎn)易性和成本的改善，各個(gè)部門(mén)的大多數(shù)生物監(jiān)測(cè)工作都將受益于宏基因組方法的采用。盡管前景廣闊，但宏基因組工作流程中仍存在技術(shù)和分析上的復(fù)雜性，在納入實(shí)驗(yàn)室常規(guī)監(jiān)測(cè)之前，需要解決或考慮這些復(fù)雜性。接下來(lái)，我們將回顧宏基因組學(xué)在樣品制備、測(cè)序和生物信息學(xué)分析方面的挑戰(zhàn)，研究宏基因組學(xué)在病原體監(jiān)測(cè)中的實(shí)際應(yīng)用示例，并評(píng)估采用這些方法所需的進(jìn)展。我們還討論了基于宏基因組學(xué)的監(jiān)測(cè)的潛力，以加速和改變?nèi)蚺?，在“同一健康”框架?nèi)檢測(cè)人類健康風(fēng)險(xiǎn)。

3 用于病原體監(jiān)測(cè)的宏基因組學(xué)

病原體監(jiān)測(cè)的宏基因組工作流程通過(guò)使用測(cè)序作為讀數(shù)來(lái)統(tǒng)一。長(zhǎng)讀長(zhǎng)和短讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)都已用于宏基因組學(xué)，其中可以使用計(jì)算方法篩選序列數(shù)據(jù)，以重建不受培養(yǎng)物或參考基因組可用性限制的精細(xì)輸出。

盡管如此，仍有一些與樣本采集和核酸處理相關(guān)的考慮因素總是特定于應(yīng)用程序并影響下游步驟。宏基因組工作流程需要考慮監(jiān)視目標(biāo)、資源可用性、操作可行性和技術(shù)兼容性，如表2中強(qiáng)調(diào)的那樣。以下部分概述了宏基因組工作流程的主要組成部分，并使用的案例研究來(lái)說(shuō)明它們的應(yīng)用。盡管樣本操作和處理的一些挑戰(zhàn)(如處理PCR抑制劑)適用于整個(gè)分子分析，但不同的宏基因組測(cè)序技術(shù)(特別是長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序)施加了額外的限制(如DNA純度、分子量等)。

對(duì)于每個(gè)目標(biāo)，討論了宏基因組工作流程的各個(gè)階段可能需要的潛在解決方案。 a 樣品處理步驟中生物量的損失或減少可能導(dǎo)致用于文庫(kù)制備的DNA不足，導(dǎo)致測(cè)序分析失敗。 b 如前所述，全基因組擴(kuò)增產(chǎn)生嵌合體。

3.1 樣品采集

該步驟在宏基因組工作流程中具有大的可變性，需要考慮各種樣品基質(zhì)及其物理和化學(xué)特性。這些包括拭子和膠帶(例如，皮膚、鼻腔和環(huán)境)，過(guò)濾器，例如，用于水、污泥和半固體(如糞便、污水、土壤或沉積物和食物)和液體(如唾液)。一些樣品(如污泥)可能需要大量收集以獲得足夠的生物量，并且相關(guān)的泄漏問(wèn)題可能會(huì)對(duì)安全取樣帶來(lái)后勤方面的挑戰(zhàn)。其他考慮因素包括需要防止交叉污染、需要培養(yǎng)儲(chǔ)備以及是否需要在穩(wěn)定培養(yǎng)基中進(jìn)行冷鏈儲(chǔ)存或運(yùn)輸以大限度地減少過(guò)度生長(zhǎng)或核酸降解。

3.2 核酸提取

核酸提取方案的選擇主要取決于使用苛刻的物理破壞(如珠擊)有效裂解細(xì)胞的能力與通過(guò)酶混合物(如me[x]taPolyzme)處理保持DNA完整性的重要性之間的權(quán)衡，me[x]taPolyzme是無(wú)色肽酶、幾丁質(zhì)酶、裂解酶、溶葡萄球菌素、溶菌酶和變?nèi)芫氐幕旌衔?。由?/span>PCR抑制劑的存在，并且需要將核酸從具有不同大小和稠度的碎片的復(fù)雜基質(zhì)中分離出來(lái)，某些樣本類型的處理本身就更具挑戰(zhàn)性，例如糞便、食物和土壤樣本。相應(yīng)地，一些測(cè)序方案可能不那么寬容，需要合適的核酸數(shù)量和質(zhì)量才能實(shí)現(xiàn)通量。

影響這一步驟的另一個(gè)方面是樣品中微生物核酸的相對(duì)比例，這是影響分析成本、靈敏度和可行性的一個(gè)因素。微生物富集可以在核酸提取之前進(jìn)行(例如，通過(guò)離心、過(guò)濾、培養(yǎng)富集或流式細(xì)胞術(shù))，也可以作為方案的一部分，例如，使用選擇性裂解步驟來(lái)消耗真核細(xì)胞或使用靶向探針來(lái)富集和擴(kuò)增微生物DNA(表2)。

3.3 文庫(kù)制備和測(cè)序

目前的測(cè)序技術(shù)要么是提供低成本短讀長(zhǎng)的第二代測(cè)序系統(tǒng)(~100個(gè)堿基對(duì)，例如Illumina)，要么是具有更長(zhǎng)讀長(zhǎng)但需要權(quán)衡成本和準(zhǔn)確性的第三代測(cè)序系統(tǒng)(例如Pacific Biosciences和牛津納米孔技術(shù))。在需要通過(guò)深度測(cè)序進(jìn)行精確定量或更高靈敏度的應(yīng)用中通常使用短讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)，而從頭組裝通過(guò)包含長(zhǎng)讀長(zhǎng)大大改善。影響監(jiān)測(cè)平臺(tái)選擇的其他特性包括便攜性、采購(gòu)和維護(hù)成本以及響應(yīng)時(shí)間(表2)。使用拇指驅(qū)動(dòng)器大小的便攜式設(shè)備進(jìn)行實(shí)時(shí)納米孔測(cè)序的新進(jìn)展極大地?cái)U(kuò)展了基于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)序的監(jiān)測(cè)計(jì)劃的可行性。雖然文庫(kù)制備工作流程在很大程度上取決于測(cè)序儀器，但li[x]nked reads和Hi-C技術(shù)的進(jìn)步已廣泛擴(kuò)展了我們從宏基因組數(shù)據(jù)生成高質(zhì)量基因組的能力。

3.4 生物信息學(xué)分析

宏基因組數(shù)據(jù)的分析可以在不同的分辨率下進(jìn)行，從使用分類器識(shí)別和量化特定分類群到基因和通路分析，到全基因組重建、注釋和系統(tǒng)發(fā)育分析。這是由一系列專業(yè)工具推動(dòng)的，如分類分類器、讀取映射器、通路重建工具和基因組組裝程序。在表3中，我們重點(diǎn)介紹了一些更流行的管道和Web工具，它們將這些功能集成到非專業(yè)人士可以訪問(wèn)的用戶友好工作流程中。此外，還有用于病原體檢測(cè)和識(shí)別的云部署臨床宏基因組計(jì)算工作流程，如SURPI和IDseq。

對(duì)于宏基因組監(jiān)測(cè)，提高生成宏基因組組裝基因組(MAGs)的能力是一個(gè)變革因素，因?yàn)樗鼈兡軌驅(qū)崿F(xiàn)更細(xì)粒度的傳播分析和更全面的抗生素耐藥性預(yù)測(cè)。其中包括改進(jìn)的分箱策略，用于檢索屬于同一基因組的短讀長(zhǎng)contigs，以及規(guī)避更高錯(cuò)誤率以產(chǎn)生更多連續(xù)組裝的長(zhǎng)讀長(zhǎng)和混合組裝程序?，F(xiàn)在可以從宏基因組數(shù)據(jù)集中重建近乎完整的基因組，但靈敏度和準(zhǔn)確性仍有待提高，特別是在一個(gè)物種的多個(gè)相似菌株存在于一個(gè)群落中的情況下。

在MAGs生成后，可以使用兩種主要方法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以輔助流行病學(xué)追蹤和傳播分析：(1)多位點(diǎn)(多基因)比對(duì)和(2)全基因組比較。雖然全基因組分析原則上提供了更高的分辨率，但水平基因轉(zhuǎn)移、重組事件和重復(fù)區(qū)域的較高錯(cuò)誤率會(huì)影響結(jié)果。通常使用平均核苷酸同源性(ANI)閾值來(lái)推斷傳播，但這些閾值需要根據(jù)特定病原體的進(jìn)化速率進(jìn)行調(diào)整。AMR基因分析通常通過(guò)映射和比對(duì)到CARD、ARG-ANNOT和MEGARes2.0等參考數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)完成。由于這些方法可能存在假陰性、任意覆蓋率和身份分界值，因此已提出深度學(xué)習(xí)方法作為替代方案。此外，通過(guò)使用Hi-C技術(shù)將移動(dòng)和染色體外AMR基因與宿主聯(lián)系起來(lái)，促進(jìn)了對(duì)這些基因的分析。

4 案例學(xué)習(xí)

在下文中，我們將討論揭示如何使用宏基因組監(jiān)測(cè)的案例研究，包括作出的具體選擇和經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，以及這將如何指導(dǎo)未來(lái)實(shí)施宏基因組監(jiān)測(cè)的努力。

4.1城市環(huán)境和交通系統(tǒng)

隨著世界日益城市化，對(duì)城市公共空間的監(jiān)測(cè)(特別是公共交通系統(tǒng))是繪制人類微生物暴露體的一種有效方法。宏基因組監(jiān)測(cè)的首批大規(guī)模應(yīng)用之一于2013-2014年在美國(guó)紐約市的地鐵中進(jìn)行。研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了該策略檢測(cè)病原體和AMR基因的可行性和可擴(kuò)展性，以及讀取層級(jí)分析的潛在缺陷。在隨后的工作中，國(guó)際me[x]taSUB聯(lián)盟將這項(xiàng)研究擴(kuò)展到來(lái)自58個(gè)城市的3700多個(gè)樣本，構(gòu)建了微生物多樣性和AMR基因的全球參考圖譜。由于環(huán)境拭子的生物量通常較低，因此使用標(biāo)準(zhǔn)化樣本收集和包含陽(yáng)性和陰性對(duì)照來(lái)大限度地減少kitome人工制品(即試劑和實(shí)驗(yàn)室相關(guān)污染物)。此外，利用短讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)的從頭組裝來(lái)識(shí)別現(xiàn)有參考數(shù)據(jù)庫(kù)中缺失的新物種和AMR基因，從而減少這種混雜因素在參考分析中的影響。

4.2 從污水中追蹤AMR

在一些大規(guī)模研究中，基于污水和牲畜糞便漿液對(duì)AMR進(jìn)行了宏基因組監(jiān)測(cè)。在一個(gè)全球污水監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中，來(lái)自60個(gè)國(guó)家74個(gè)城市的未經(jīng)處理的污水被冷凍并集中處理，以獲得短讀長(zhǎng)宏基因組數(shù)據(jù)和組裝。共鑒定出屬于408個(gè)基因類別的1625個(gè)不同的AMR基因，包括blaNDM、mcr和optrA基因，它們是使用抗生素的AMR決定因素。研究發(fā)現(xiàn)，AMR總豐度因地區(qū)而異，其值與社會(huì)經(jīng)濟(jì)因素(如衛(wèi)生條件)高度相關(guān)。因此，大規(guī)模污水監(jiān)測(cè)可以提供一種方便、低成本的人群AMR監(jiān)測(cè)方法。這些研究強(qiáng)調(diào)采樣和運(yùn)輸物流可以得到解決，且收集和處理的進(jìn)一步自動(dòng)化將使這種方法對(duì)監(jiān)測(cè)更具吸引力。

4.3 醫(yī)療環(huán)境

Lax等人開(kāi)創(chuàng)了醫(yī)療環(huán)境的大規(guī)模宏基因組圖譜，以確定新建醫(yī)院中的微生物定植和傳播模式。由于其作為高風(fēng)險(xiǎn)環(huán)境的重要性，Brooks等人將重點(diǎn)放在新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房，使用鳥(niǎo)槍法宏基因組測(cè)序和MAGs來(lái)證明微生物在患者和環(huán)境之間的直接交換。此外，他們的研究表明，在為期一年的研究期間，重癥監(jiān)護(hù)病房環(huán)境中的一些菌株持續(xù)存在。在的研究中，我們展示了基于混合宏基因組組裝的多藥耐藥微生物在醫(yī)院環(huán)境中的持久性和廣泛分布。此外，與相隔8年的患者分離株進(jìn)行比較顯示出高度的相似性，這突出了AMR庫(kù)的持久性。該研究使用準(zhǔn)宏基因組學(xué)(即有意修飾微生物組的宏基因組學(xué)，例如通過(guò)培養(yǎng)富集)來(lái)富集抗生素耐藥性微生物，并從數(shù)百個(gè)樣本中獲得大量高質(zhì)量的MAGs(>2000)。收集曲線分析表明，只需50份樣本就足以在醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)菌株和AMR監(jiān)測(cè)。對(duì)低生物量樣本分析和實(shí)時(shí)測(cè)序的進(jìn)一步改進(jìn)可能會(huì)使這些方法在響應(yīng)時(shí)間至關(guān)重要的醫(yī)療環(huán)境中更具吸引力。還需要進(jìn)行沙盒試驗(yàn)，以提供證據(jù)證明其快速跟蹤疫情和預(yù)防感染的能力，從而為常規(guī)采用提供依據(jù)。

4.4 人畜共患病病毒庫(kù)

宏基因組學(xué)方法已被用于檢測(cè)和表征各種潛在宿主中的人畜共患病病原體，如節(jié)肢動(dòng)物媒介、蝙蝠和野鴨。已從蜱、蚊子、蝙蝠的胃腸道排泄物和野鴨糞便中檢測(cè)到已知的、新出現(xiàn)的和新的病毒病原體，從而突出了宏基因組監(jiān)測(cè)人畜共患病病毒庫(kù)的效用。相應(yīng)地，全球病毒組計(jì)劃的啟動(dòng)是一項(xiàng)大規(guī)模努力，旨在開(kāi)發(fā)潛在人畜共患病病毒病原體的全球圖譜，并提高我們發(fā)現(xiàn)、檢測(cè)和診斷可能威脅人類健康的病毒的能力。病毒宏基因組學(xué)帶來(lái)了重大的技術(shù)挑戰(zhàn)，包括安全問(wèn)題、大多數(shù)樣本中的低病毒載量、RNA降解和準(zhǔn)物種多樣性。因此，通過(guò)開(kāi)發(fā)新的自動(dòng)化、核酸提取和生物信息學(xué)工具來(lái)解決這些問(wèn)題，將是提高我們通過(guò)宏基因組學(xué)監(jiān)測(cè)和了解龐大病毒圈(特別是冠狀病毒、流感病毒和埃博拉病毒)的能力的關(guān)鍵。

綜上所述，這些案例研究強(qiáng)調(diào)了使用宏基因組學(xué)在各個(gè)感興趣領(lǐng)域進(jìn)行調(diào)查的無(wú)與倫比的廣度和深度。統(tǒng)一分析多種病原體、在單一高通量分析中整合跨領(lǐng)域信息以及對(duì)AMR基因進(jìn)行監(jiān)測(cè)的能力提供了以前不可行的分析機(jī)會(huì)。此外，在一些研究中產(chǎn)生的高質(zhì)量宏基因組組裝基因組進(jìn)一步促進(jìn)了全基因組研究和高分辨率系統(tǒng)發(fā)育，而以前只能通過(guò)較低通量的培養(yǎng)和分離基因組測(cè)序過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，人們對(duì)進(jìn)行常規(guī)宏基因組監(jiān)測(cè)有濃厚的興趣，因?yàn)楫a(chǎn)生的數(shù)據(jù)可用于回答生物學(xué)研究問(wèn)題。

5 宏基因組學(xué)監(jiān)測(cè)的廣泛應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)

盡管在監(jiān)測(cè)中實(shí)施宏基因組工作流程有著堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，但廣泛采用該技術(shù)仍存在挑戰(zhàn)。在本節(jié)中，我們將重點(diǎn)介紹其中的一些問(wèn)題，并討論將為常規(guī)應(yīng)用鋪平道路的正在進(jìn)行的開(kāi)發(fā)。

5.1 靈敏度、特異性和標(biāo)準(zhǔn)化

采用宏基因組學(xué)方法的一個(gè)重要考慮因素是檢測(cè)的靈敏度、特異性和可重復(fù)性，此處討論的宏基因組案例研究中沒(méi)有詳細(xì)研究這一方面。其他研究試圖確定鳥(niǎo)槍法宏基因組分析相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的靈敏度和特異性。與其他分子方法(如PCR)類似，宏基因組分析的靈敏度和特異性取決于方案工作流程的優(yōu)化，包括多個(gè)因素，例如不同的目標(biāo)病原體和不同(有時(shí)相同)樣品處理工作流程，以大限度地提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。這取決于可用的資源和樣本生物量，實(shí)施起來(lái)可能可行，也可能不可行，這構(gòu)成了采用的瓶頸。分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展的進(jìn)展以及機(jī)器人技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化的采用(參見(jiàn)突破性技術(shù)部分)將極大地解決這一相關(guān)挑戰(zhàn)并促進(jìn)廣泛應(yīng)用。

此外，廣泛的樣品基質(zhì)和多步驟定制實(shí)驗(yàn)室和分析工作流程是變異性的來(lái)源，使宏基因組分析的實(shí)施變得復(fù)雜。盡管存在這些挑戰(zhàn)，但有研究表明，通過(guò)嚴(yán)格的優(yōu)化、標(biāo)準(zhǔn)化和驗(yàn)證，可以實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的高重現(xiàn)性?？傮w而言，工作流程標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量保證的努力已經(jīng)取得了進(jìn)展，應(yīng)該通過(guò)自動(dòng)化(易于使用)、降低分析成本(測(cè)序成本和多路復(fù)用)以及對(duì)生物信息學(xué)工具進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試來(lái)輔助。關(guān)鍵的是，測(cè)序成本已經(jīng)接近閾值(不到100美元)，與常規(guī)監(jiān)測(cè)方案的總成本(包括人工成本)相當(dāng)。端到端標(biāo)準(zhǔn)化(包括生物信息學(xué))和宏基因組工作流程的驗(yàn)證可能有助于更好地理解。

盡管宏基因組數(shù)據(jù)的收集和解釋具有固有的復(fù)雜性，但在臨床診斷中越來(lái)越多地采用鳥(niǎo)槍法宏基因組方法表明，這種檢測(cè)可以標(biāo)準(zhǔn)化和驗(yàn)證。然而，由于監(jiān)測(cè)計(jì)劃影響公共衛(wèi)生決策，宏基因組學(xué)的接受度受到靈敏度、特異性和經(jīng)濟(jì)可行性之外的考慮因素的影響。例如，關(guān)注的范圍從微生物污染對(duì)結(jié)果的影響和相關(guān)物種生物信息學(xué)分析的保真度到檢測(cè)到的病原體的生存能力和傳染性以及估計(jì)所構(gòu)成公共健康風(fēng)險(xiǎn)的能力。因此，除了嚴(yán)格的方案標(biāo)準(zhǔn)化、常見(jiàn)樣本類型的端到端指導(dǎo)、納入各種控制、質(zhì)量保證和熟練樣本的管道驗(yàn)證以及參考標(biāo)準(zhǔn)的使用外，還需要進(jìn)一步研究基于宏基因組監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)模型的開(kāi)發(fā)。由于病原體監(jiān)測(cè)的主要目標(biāo)是提供關(guān)于潛在公共衛(wèi)生威脅的早期情報(bào)，因此需要對(duì)該情報(bào)進(jìn)行后續(xù)確認(rèn)。此外，監(jiān)測(cè)的監(jiān)管影響將是復(fù)雜的，由每個(gè)管轄區(qū)根據(jù)當(dāng)?shù)乜捎觅Y源、當(dāng)?shù)乇O(jiān)測(cè)需求、流行病學(xué)和當(dāng)?shù)卣邅?lái)確定。

5.2 技術(shù)障礙

一項(xiàng)可以降低采用宏基因組監(jiān)測(cè)的障礙的進(jìn)展是li[x]nked reads、合成長(zhǎng)讀長(zhǎng)和Hi-C reads的試劑盒和方案的可用性。與此同時(shí)，測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，特別是在生成高精度長(zhǎng)讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)和超長(zhǎng)讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)方面，以及進(jìn)行實(shí)時(shí)、現(xiàn)場(chǎng)部署的全基因組分析的能力，使宏基因組監(jiān)測(cè)成為現(xiàn)實(shí)的選擇。對(duì)于常規(guī)研究而言，價(jià)格低廉、功能強(qiáng)大、保質(zhì)期長(zhǎng)的測(cè)序試劑盒是正在開(kāi)發(fā)的重要領(lǐng)域。

同時(shí)，能夠?qū)﹂L(zhǎng)讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行敏感分類的生物信息學(xué)算法(如me[x]taMaps、快速準(zhǔn)確的宏基因組組裝以及基于組合和覆蓋率的組裝分箱)正在使強(qiáng)大的宏基因組監(jiān)控工作流程觸手可及。需要大量的研究投資來(lái)改進(jìn)宏基因組的應(yīng)變分解組裝。具體來(lái)說(shuō)，宏基因組組裝的實(shí)用性和可靠性仍然受到無(wú)法組裝難以組裝的基因組內(nèi)容(如質(zhì)粒、16S rRNA和重復(fù)