細胞通過水流出引發(fā)的體積改變可影響影響細胞硬度及干細胞命運

細胞可根據其局部微環(huán)境改變機械特性，這與決定細胞功能有關，甚至可以影響干細胞情況。美國研究人員Ming Guo等確定了細胞硬度和細胞體積之間具有穩(wěn)定且統(tǒng)一的關系。當細胞在基質上鋪展時，它的體積減小，而硬度隨之增加。細胞皮質和胞質硬度會因各種擾動而隨體積變化，包括不同的基質硬度、細胞鋪展面積和外部滲透壓變化。細胞體積減少是水流出的結果，這也導致細胞內分子擁擠程度相應增加。此外，細胞體積變化進而硬度變化會改變干細胞分化。這些結果揭示了細胞硬度和細胞體積間不可思議的關系，對細胞生物學具有深遠影響。

背景

細胞體積是一個高度受調控的特性，它會影響無數功能，會隨著細胞生命循環(huán)發(fā)生改變，會隨著細胞質膜生長、蛋白、DNA及其它包內物質的增加而增加。當細胞通過有限空間遷移時，細胞體積也會發(fā)生快速變化，此時體積變化是水運輸到胞外實現的。而這種快速變化會導致胞內物質及分子擁擠，從而產生諸多嚴重影響。通過施加外部滲透壓可迫使水流出細胞，直接使細胞體積減少，導致胞內物質濃度增加，分子擁擠度增加。此外還會改變細胞力學，導致硬度增加、影響蛋白折疊和運輸以及染色質凝聚。這種滲透壓引發(fā)的體積變化對細胞行為產生的巨大影響促生了一個問題，即等滲情況下，細胞是否會通過水外流改變體積，通過改變分子擁擠度來調節(jié)力學及行為。

本研究證明了當細胞培養(yǎng)于相同的等滲條件時，如胞外環(huán)境較硬，細胞會通過水外流減少細胞體積，這對細胞力學和細胞生理有巨大影響。當一個細胞在堅硬基質上鋪展開時，它體積減少，細胞行為與施加了外部滲透壓的細胞類似，即隨著細胞體積減小，皮質和胞質硬度增加，而細胞核體積也隨細胞體積減小而減小。此外干細胞分化受細胞體積變化的影響也很強烈。這些結果表明不同環(huán)境下的細胞可通過水外流來改變體積，引發(fā)胞內分子擁擠度變化并影響細胞力學、生理及行為，對細胞命運產生深遠影響。

結果

01-施加外部滲透壓情況下，細胞體積模量和剪切模量隨細胞體積減小而增加

通過添加300Da聚乙二醇（PEG300）控制外部滲透壓，直接探索細胞體積變化的后果。熒光標記細胞質和細胞表面測量細胞體積，共聚焦顯微鏡以3D模式識別細胞邊界。細胞饑餓一夜后成像以消除自然細胞周期變化影響。測量體積與已有原子力顯微鏡（AFM）測量體積一致。同一樣品將共聚焦測量結果與高分辨率結構光照明顯微術（SIM）測量結果比較，作進一步驗證。兩種技術測得的細胞體積一致，表明測量不確定度< 10%。

為探索細胞體積對外部滲透壓的依賴性，在玻璃基底上培養(yǎng)A7細胞，并向培養(yǎng)基中加入濃度逐漸增加的PEG 300，由于PEG 300不穿透細胞膜，因此實現外部滲透壓增加。由于滲透壓對細胞皮質平衡的影響可以忽略不計，而胞內滲透壓由離子和小蛋白質的濃度控制。因此為了補償外部滲透壓的增加，細胞必須通過離子流入或水流出來增加其內部滲透物濃度。研究發(fā)現細胞體積隨著外部滲透壓的增加而減少，去除外部滲透壓后細胞體積恢復到原始值，因此這是水流出引起的。細胞在極端滲透壓下可達小體積；這反映了胞內總物質以及水合離子和蛋白質所需的滲透惰性水的總體積。排除體積的理想氣體系統(tǒng)中，滲透壓P和細胞體積V之間的關系符合P = NkBT/(V-Vmin)，其中N是細胞內滲透物數量，kB是玻爾茲曼常數，T是溫度，Vmin是小體積?？捡R斯亮藍測量滲透壓縮前后每個細胞的總蛋白含量，發(fā)現沒有差異，證實細胞體積的減少是水流出所致。

隨著細胞體積的減少，胞內離子和其他物質濃度增加，去除額外的水并進一步縮小細胞越來越困難。水離開細胞的阻力是滲透體積模量，定義為B = -VdP/dV ~ -VΔP/ΔV。通過改變滲透壓并測量玻璃基底培養(yǎng)的A7細胞的總體積得到B，發(fā)現它隨細胞體積的減少而增加。利用P對體積的依賴性，可預測體積模量即B = NkBTV/(V-Vmin)2。該函數形式與數據匹配極好。擬合確定的Vmin值為2,053 ± 30 μm3，與極端滲透壓下去除所有滲透活性水時測得的細胞小體積（約2,100 μm3）一致。擬合還提供了N值，得到濃度約200 mM，與細胞內已知的鹽濃度一致。表明滲透壓存在情況下，離子和蛋白質的總量保持近似恒定。雖然滲透壓平衡很大程度上受離子濃度控制，但隨著游離水離開細胞，大蛋白質和細胞器的濃度也會增加。正是這些蛋白質和細胞器（包括細胞核）的體積決定了Vmin。此外，隨著細胞接近其小體積，胞內分子擁擠程度必然增加，而這可能導致細胞行為發(fā)生其他變化。

諸多細胞特性中，細胞皮質硬度在滲透壓存在時受分子擁擠度影響會隨體積變化。使用光學磁性儀（OMTC）測定A7細胞的皮質剪切模量G，從而確定皮質硬度變化。OMTC測得結果與已有AFM結果在數量上一致。隨著外部滲透壓增加，皮質剪切模量和體積都快速且同時變化。去除外部滲透壓后，皮質剪切模量立即恢復至初始值。細胞皮質硬度與體積模量趨勢相同，可完全用相同函數描述。擬合得到的Vmin值為2,004 ± 41 μm3，與體積模量得到的值非常一致。但剪切模量的值始終比體積模量小三個數量級。這種相似性意味著分子擁擠對兩者都有影響。

細胞剪切模量的主要源于皮層硬度。但細胞結構呈高度異質性，內部要柔軟得多；細胞的細胞質是弱彈性凝膠，其剪切模量比皮層的低三個數量級。為了測量細胞質的硬度，將PEG包被的聚苯乙烯珠微注射到A7細胞中，激光鑷子確定胞質剪切模量。發(fā)現胞內剪切模量隨細胞體積減少而增加，遵循與皮質剪切模量和體積模量相同的趨勢。隨著細胞體積進一步減小，細胞質剪切模量明顯增加，但值太大無法用激光鑷子測量。在可及的范圍內，胞質剪切模量與其它兩個模量函數形式相同，但比皮質剪切模量的值小三個數量級。

 玻璃上生長的A7細胞的機械特性與細胞體積在外部滲透壓下的函數。（A）滲透體積模量（灰色三角）、皮質剪切模量（紅色三角）和胞質剪切模量（空心三角）隨細胞體積減少而增加。穿過灰色三角的虛線表函數B = NkBTV/(V-Vmin)2 (R2 = 0.99)的小二乘擬合。穿過皮質和胞質模量的虛線擬合完全相同，分別縮放500和100,000倍。（B）OMTC測量的單個A7細胞的皮質剪切模量，施加0.26 M PEG 300滲透壓后立即增加，與細胞體積減少同時發(fā)生。

02-當在較硬的基質上培養(yǎng)時，細胞體積減小

皮質硬度是細胞力學的一個關鍵物理特性，通常隨著細胞生長基質硬度的降低而降低。即使在等滲條件下細胞形態(tài)也可隨基質硬度變化。在涂有Ⅰ型膠原的100μm聚丙烯酰胺（PA）凝膠上培養(yǎng)A7細胞，通過改變凝膠成分使其剪切模量可在0.1-10 kPa變化，與自然組織的生理彈性相匹配。測量細胞鋪展面積，已知較硬基質上培養(yǎng)的細胞鋪展面積增加。然而結果發(fā)現細胞體積并不守恒，隨著基質硬度增加，細胞體積減少。在堅硬基質上生長的細胞的體積較柔軟基質上減少約40%。其他哺乳動物細胞型，包括HeLa、NIH 3T3、小鼠間充質干細胞（mMSCs）和原代人氣道平滑肌細胞（HASM）表現出類似的行為。證實細胞體積依賴于基質硬度具有普遍性。因此，即使外部滲透壓不變，細胞體積也會改變。

粘附細胞的形態(tài)和體積隨基質硬度的增加而改變。（A）A7細胞的俯視圖和側視圖，分別固定于涂有Ⅰ型膠原的硬（剪切模量10kPa）和軟（剪切模量1200Pa）PA凝膠基質上。肌動蛋白皮質（綠色），細胞核（藍色）。（B）細胞面積隨基質硬度增加而增加。（C）細胞體積隨基質硬度增加而減小。

03-限制細胞鋪展面積會使細胞體積增大

在玻璃基底上培養(yǎng)A7細胞，微繪制不同大小的膠原“島”以限制細胞的粘附面積。發(fā)現與鋪展面積不受限制的細胞相比，鋪展面積受限的細胞高度更高。此外細胞體積也隨鋪展面積的減少而增加。在較軟基底上培養(yǎng)時觀察到同樣效果，即如果細胞鋪展面積受限小于該基底自由鋪展面積，則細胞體積增加。不同粘附面積或不同基底硬度都是如此。

04-細胞體積減少是細胞內水流出所致

監(jiān)測一個胰蛋白酶化細胞在硬基質上的鋪展情況，以確定等滲條件下細胞體積減少是由于蛋白質含量變化還是由于水的流出。細胞在約20min內從的圓形變?yōu)橥耆佌归_狀態(tài)。在此期間，細胞體積隨著展開面積增加而減少。不同受限區(qū)域、不同硬度基質上，體積和展開面積間的關系相同。水可以在一分鐘內離開細胞，而哺乳動物細胞因生長而產生的胞內物質數量變化通常需要幾個小時。因此等滲條件下的體積減少有可能是通過水交換來控制的。

測量硬基質和軟基質上培養(yǎng)細胞每細胞的總蛋白質含量，發(fā)現沒有差異。用純PEG置換培養(yǎng)基對細胞施加極端滲透壓，從細胞中提取所有滲透活性水，發(fā)現所得小體積Vmin與基質硬度無關。由于Vmin可大致反映胞內物質和滲透不活躍的結合水的量，因此細胞體積的變化是由胞內游離水的交換引起的。

A7細胞體積隨細胞鋪展面積減少而增加。（A）玻璃上不同大小微島上A7細胞的3D圖像。（B）隨著玻璃上細胞鋪展面積增加，細胞體積減少。（C）不同硬度基質上，細胞體積與投影面積的函數（灰色圓圈；n > 200）。（D）單個細胞在硬基質上動態(tài)附著時細胞鋪展面積和體積的變化（n = 3）。（E）細胞體積因水流出而減少的示意圖。

05-細胞鋪展過程中，離子通道和肌動球蛋白細胞骨架與細胞體積減少有關

等滲條件下細胞鋪展時的水流出與滲透壓存在時的水流出原因不同。細胞鋪展過程中，細胞體積要在等滲條件下減少，為了讓水離開細胞，滲透物的總量必須改變。由于每個細胞的蛋白量保持不變，那么可能是與周圍環(huán)境發(fā)生了離子交換。已知細胞鋪展過程中細胞骨架張力增加，而這與離子通道活性增加有關。因此在細胞完全鋪展后使用0.1mM NPPB抑制氯離子通道。當離子通道被阻斷，隨著基質硬度增加，細胞體積的減少受到抑制。表明等滲條件下細胞體積的減少需要離子通道活性，通過改變內部滲透物的總量來實現。

為進一步測試活躍的細胞過程是否會影響細胞體積變化，用10μM 布雷他?。?/span>blebbistatin）處理細胞以抑制肌球蛋白II運動活性，直接降低細胞骨架張力。發(fā)現布雷他汀處理阻礙了細胞在硬基質上的體積減少。使用2 mM疊氮化鈉和10mM 2-deoxyglucose消耗ATP抑制一般運動同樣觀察到類似效果。進一步證明等滲條件下，活躍的細胞過程與體積減少有關，細胞必須使用離子通道主動控制滲透物濃度，以影響水的流出并改變體積。

藥物處理和滲透壓下的細胞形態(tài)和體積。（A）對照細胞和ATP耗竭細胞在極端滲透壓下，硬基質和軟基質上的三維形態(tài)。細胞質（綠色），細胞核（黃色）。（B）無主動收縮（布雷他汀處理和ATP耗竭）且處于極度滲透壓下的細胞，體積與基質硬度不呈依賴性；氯離子通道被抑制（NPPB處理）的細胞，體積對基質硬度的依賴性較弱。

06-細胞模量對細胞體積有普遍依賴性

等滲條件下細胞鋪展面積變大，細胞皮質硬度隨基質硬度增加而增加，當固定基質硬度改變鋪展面積時，細胞皮質硬度也會增加。當基質硬度和鋪展面積固定時，滲透壓增加細胞硬度也增加，細胞體積減小。因此，假設細胞體積變化是所有這些情況下觀察到的細胞硬度變化的共同描述因子。將皮質硬度繪制為體積的函數，即在較軟基質上生長時，細胞硬度隨體積的增加而降低。當在固定硬度、不同粘附面積的基質上生長時，細胞硬度以類似的方式隨體積增加而降低。當生長在軟基質上并被有外部滲透壓時，以及生長在堅硬且鋪展面積高度受限基質上有滲透壓時，細胞硬度增加。將所有數據繪制在一張圖表上，數據出現重疊并且細胞硬度與細胞體積之間表現出普遍相關性。因此細胞硬度變化可用細胞體積來描述。本文數據都是由單一細胞類型A7獲得的，其他細胞類型中盡管振幅和體積上有所偏移，但也觀察到類似的情況。

拆分數據，在不施加外部滲透壓情況下，細胞只對基質硬度或鋪展面積的變化做出反應，符合G ∝ 1/V2。如果包括所有數據，完整行為符合G∝kBTV/(V-Vmin)2。雖然沒有模型預測剪切模量的行為，但它在函數形式上與相同體積范圍內的體積模量行為相同，即B∝kBTV/(V-Vmin)2，通過測量細胞P-V關系得到，反映了當水從細胞中抽出時分子擁擠程度增加帶來的影響。因此類似的擁擠現象也是皮質剪切模量變化的原因。此外多重擾動下滲透體積模量和細胞質剪切模量都普遍依賴于細胞體積

添加布雷他汀抑制肌動球蛋白收縮的數據以探索細胞硬度和細胞體積之間相關性的普遍性，發(fā)現皮質硬度與體積還是完全相同的函數曲線。當ATP完全耗盡時，數據趨勢相同。不僅是分離的細胞，2D細胞單層中也觀察到類似行為。將上皮MCF10-A細胞生長為密度不同的單層，測量相應的細胞體積和皮質剪切模量，發(fā)現細胞體積隨細胞密度的增加而減少。細胞體積和硬度依舊存在相關，即隨著細胞密度增加，細胞體積減少，皮質硬度增加，符合1/V2。這些結果意味著細胞體積參與決定細胞力學。

 細胞皮質硬度與細胞體積的關系。（A-D）不同條件下，A7細胞的細胞皮質剪切模量對細胞體積的依賴性，包括不同硬度基質（A），不同大小微圖案的硬基質（B），剪切模量100Pa的軟基質并施加逐漸增加的滲透壓（C），玻璃基質上微圖案限制細胞鋪展并施加滲透壓（D）。（E）細胞皮質剪切模量與細胞體積成比例，圖示為細胞生長在不同硬度基質上（灰色圓圈），微圖案限制有效鋪展面積的玻璃基質上（藍色方塊），有滲透壓的軟基質上（剪切模量100Pa，綠色倒置三角形），未圖案化有滲透壓玻璃基質（紅色三角形），圖案化有滲透壓玻璃基質（黃色菱形），10μM布雷他汀處理（青色五邊形）或ATP耗盡（黑色三角形）的玻璃基質。實線表示數據的冪律擬合。虛線表示符合G∝kBTV/(V-Vmin)2。

07-細胞核體積跟隨細胞體積變化

核膜像細胞膜一樣，是選擇性滲透的，允許水交換。因此需要探究細胞流出的水是否也來自細胞核。用熒光標記細胞核，3D共聚焦顯微鏡測量核體積。發(fā)現細胞核體積隨細胞體積變化，不同基質、等滲條件下生長的細胞如此，體積因外部滲透壓而改變的細胞也是如此。表明隨著細胞體積的減少，細胞核也變得更加擁擠，這對細胞核內的運動程度有直接影響。測量了GFP標記的組蛋白H2B的波動運動。計算均方位移，發(fā)現當外部滲透壓使分子擁擠增加時，波動水平降低。

細胞核體積及核動力學隨細胞體積的變化。（A）細胞核體積一般隨細胞體積變化，減少程度與基質硬度、鋪展面積、滲透壓力的增加成比例，測試的各細胞型中核體積與細胞體積間的比率近似恒定。（B）MCF-10A細胞核中GFP標記組蛋白的均方圖，反映染色質位置波動，0.1 M PEG300極端滲透壓情況下減少。

08-細胞體積改變可調控干細胞命運

由于細胞體積與細胞硬度以及分子擁擠等其他參數有內在聯系，因此需要探究細胞體積對干細胞分化的影響。通過滲透壓從外部施壓使細胞體積變化，這會導致細胞硬度變化，但鋪展面積和基質特性沒有變化，也不會改變細胞內的張力。在兩種不同PA凝膠基質上生長mMSC，分別為剪切模量7kPa的硬基質和剪切模量0.2kPa的軟基質。軟基質上的細胞體積通常較大，用0.1 M PEG 300（+100 mOsm）施加額外滲透壓使兩種凝膠上的細胞體積相匹配。當體積匹配時，細胞硬度也匹配。將細胞置于支持成骨和成脂命運的雙潛能分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周后，通過堿性磷酸酶（ALP）活性觀察?？梢娕c軟基質上未受干擾的細胞相比，堅硬基質上成骨分化增加。軟基質+滲透壓也表現出ALP活性增強，表明優(yōu)先成骨分化。Western分析成骨生物標記物runt相關轉錄因子2（RUNX2）和骨唾液蛋白（BSP）表達證實了這一點。

使用低滲條件（-80 mOsm）使硬基質上的細胞膨脹，使細胞體積和細胞核體積與軟基質上的細胞相匹配。當體積匹配時，細胞硬度也匹配。通過油紅O（ORO）原位染色中性脂質堆積，成脂生物標志物PPAR-γ表達可觀察到大量成脂分化。表明可以通過改變干細胞的體積來影響其向成骨或成脂方向的分化，核內或細胞內擁擠會影響干細胞命運。

09-干細胞命運影響細胞體積

在缺乏強化學信號的情況下，基質硬度或外部滲透壓等物理特性會影響干細胞的分化。但化學信號通?？梢猿竭@些物理信號。在柔軟的PA凝膠上培養(yǎng)mMSCs（偏向成脂分化），向培養(yǎng)基中加入補充劑（β-磷酸甘油、抗壞血酸和地塞米松）誘導細胞向成骨方向分化。結果發(fā)現mMSCs進行成骨分化，且該過程中細胞體積減小，甚至成骨分化前就已經減小。對硬基質上的mMSCs用地塞米松單獨化學誘導成脂，細胞體積增加。表明細胞體積和干細胞分化密切相關。

細胞體積影響mMSCs分化。（A-F）成骨分化。（A）成骨和成脂組合誘導下mMSC培養(yǎng)1周后，原位染色ALP（黑色）核細胞（DAPI，藍色），發(fā)現有滲透壓時，硬基質（剪切模量7kPa）和軟基質（剪切模量100Pa）上成骨分化增加。（B）mMSC成骨分化的平均百分比。（C）mMSCs培養(yǎng)3天后Western分析成骨蛋白表達。（C-F