不同參數(shù)對診斷超聲聯(lián)合微泡下腫瘤血管通透性影響的研究

        近年來，國內(nèi)外研究表明診斷超聲所介導的超聲靶向微泡破壞技術(shù)( Uitrasound-targeted microbubblee destruction，UTMD)可通過提高腫瘤組織血管通透性，從而有效增加病變區(qū)藥物有效治療濃度，或可成為提高腫瘤化療效果的新手段。影響UTMD技術(shù)效果的因素是多方面的，包括造影劑微泡劑量、超聲輸出強度、超聲頻率、造影劑注射方式、超聲波輻照方式、超聲輻照時間等，同時各因素間還可能相互制約。為了晟大程度的提高腫瘤血管通透性，還需要對影響其效果的主要參數(shù)進行系統(tǒng)研究，可以為下一步深入實驗及臨床研究提供可靠參數(shù)?；诖?，本研究使用低頻診斷超聲聯(lián)合商業(yè)化的SonoV ue超聲造影劑微泡對大鼠皮下移植瘤進行持續(xù)輻照，主要探索MI、超聲輻照時間及微泡劑量對腫瘤血管通透性的影響，從而為優(yōu)化低頻診斷超聲聯(lián)合微泡的影響參數(shù)提供實驗依據(jù)。

        資料與方法

        1.實驗動物和癌株

        清潔級SD大鼠132只，雌雄不拘，體質(zhì)量100-120 9。出生2周的Wistar雄一眭幼鼠1只，體質(zhì)量62 9，供瘤株形成腹水傳代使用。均由我院實驗動物中心檢疫并提供。 大鼠RH-35肝癌細胞株購自上海生物工程股份有限公司，培養(yǎng)RH35細胞株濃度至1×10／ml后，取1ml細胞懸液注人Wistar大鼠腹腔．1周后抽取癌性腹水，以1 200 r/min速度離心5 mln后棄上清液，將下層濃縮的瘤細胞懸液約。．l ml接種于SD大鼠右腿皮下，共接種132只。接種5d后超聲觀察，當腫瘤長至l 5 cm左右時用于實驗。

        2．主要儀器與材料
        采用Sicmens S2000超聲診斷儀，選擇9L4探頭(8 MHz)進行超聲定位與造影檢查，選擇4Pl探頭(1. 75 MHz)進行持續(xù)超聲輻照；DU800紫外分光光度計（貝克曼公司，德國）；//O戊巴比妥鈉溶液；2蹦伊文氏藍( EB，購自美國SI(;MA公司)；bonovue超聲造影劑，實驗前以5 ml生理鹽水溶解}甲酰胺（分析純）溶液。

        3.實驗分組
        為了探索不問MI、輻照時間、微泡劑量對腫瘤血管通透性的影響，實驗共分3部分。 第1部分探索不同輻照時間對腫瘤血管通透性的影響，依據(jù)超聲輻照時間的不同分為：對照組。、1、3、5、7、iO min及15 min組，Ml為1 3，靜脈推注300 vl/kg的sonovue超聲造影劑。將實驗功物以隨機分組方法分為7組，每組6只。 第2部分探索不同Ml對腫瘤血管通透性的影響，依照超聲MI的不同分為：對照組M1 0、MI0 l、MI 0 4、MI 0 8、Ml 1 0、MI l.1、M1 1.2及M1l.3組，超聲輻照腫瘤組織10 min前經(jīng)靜脈注射300ul/kg的SonoVue超聲造影劑。將實驗動物以隨機分組法分為8組，每組6只。 第3部分探索不同微泡劑量對腫瘤血管通透性的影響，依據(jù)實驗時微泡劑量的不同分為：對照組0、30、60、iOO、200、300 Vl/kg及400 Vl/kg組，均以MI為1 3的超聲輻照腫瘤組織iO min。將實驗動物以隨機分組方法分為7組，每組6只。

        4．實驗方法

        (l)使用Z蹦的戊巴比妥鈉30 mg/kg對SD大鼠皮下移植瘤模型腹腔注射，麻醉成功后仰臥于自制手術(shù)臺上，使用硫化鈉溶液在腫瘤局部脫毛建立超聲輻照聲窗。選用S2000超聲診斷儀9L4探頭觀察大鼠皮下移植瘤，顯示佳肝臟超聲影像。
         (2)選擇S2000超聲診斷儀4Pl探頭介導超聲靶向微泡破裂技術(shù)，經(jīng)靜脈緩慢推注50 mg/kg劑量的EB溶液，后團注相應劑量的SonoVue超聲造影劑，并追加0 5 ml生理鹽水沖管，將實驗動物按相應分紐給予相應處理。 (3)將實驗動物給予相應處理1h后打開胸腔，將自制輸液器自左室插管進入主動脈，灌注含肝素鈉的生理鹽水100 ml[壓力為160-180 cm H2O，(lcm H2O=98 Pa）]，確保從剪開的右心房流出的液體變?yōu)槌吻鍨橹?，隨即剝離皮下移植腫瘤組織。 (4)使用電子天平稱重腫瘤組織塊，剪成小碎塊后浸入10 ml甲酰胺溶液中，于37℃恒溫水浴箱中孵育24 h，提取腫瘤組織中的EB，以3 000 r/min速度在低溫高速離心機中離心5 min，用DU800紫外分光光度計測定離心后的上清液在620 nm大吸收峰處的光密度值。根據(jù)求得的EB溶液一光密度值標準陸線可求得淬取液的EB濃度，將EB滲出量除以腫瘤質(zhì)量即得到單位瘤組織中的EB含量，作為恒量各實驗組腫痛血管通透性的指標，從而分析不同處理方法對腫瘤血管通透性的影響。

        5.統(tǒng)計學分析

        使用SPSSl3. 0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，各實驗組單位腫瘤組織EB滲出結(jié)果比較采用單因素方差分析，各組間比較眥P<0. 05為有統(tǒng)計學差異。

        結(jié) 果

        1．SD大鼠皮下移植瘤模型建立及實驗完成情況
        120只SD大鼠皮下接種濃縮腫瘤腹水1周后均建模成功．成功率為iOO%，無自發(fā)消退現(xiàn)象發(fā)生。建模成功的大鼠模型在實驗過程中困麻醉意外、推注試劑速度過快、混入空氣栓塞等原因致死12只，終成功完成108次實驗，成功率達90%。

        2．不同實驗組大鼠腫瘤組織EB含量檢測 (l)超聲強度對腫瘤血管通透性影響不同等級MI超聲聯(lián)合微泡刑腫瘤組織輻照下腫瘤組織中EB含量，見表1，結(jié)果顯示當超聲輸出強度MI≥0 4時腫瘤組織中EB含量明顯增加，且隨著MI的增長，腫瘤組織中EB含量也隨之增加，各實驗組與對照組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，當Ml為1.3時達到大值。

(2)超聲造影劑劑量對腫瘤血管通透性影響不同劑量超聲造影劑下診斷超聲聯(lián)合微泡輻照腫瘤組織下腫瘤組織中EB含量，見表2，結(jié)果顯示隨著超聲造影劑劑量的增長，腫瘤組織中EB含量呈線性增加，各實驗組與列照組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0 05)，當微泡劑量為300pVkg時腫瘤組織中的EB含量達到大值。

(3)超聲輻照時間對腫瘤血管通透性影響不同超聲輻照時間下診斷超聲聯(lián)合微泡輻照腫瘤組織下腫瘤組織中EB含量，見表3，結(jié)果顯示隨著超聲輻照時間的增長，腫瘤組織中EB含量呈線性增加，各實驗組與對照組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0 05)，當輻照時間為io min時腫瘤組織中的EB含量達到大值。

伊文氏藍( EB)由于進入血液系統(tǒng)后能夠迅速與血液中的白蛋白進稈結(jié)合，白蛋白是相對分子量為67 000的大分子物質(zhì)，正常情況下不能透過腫瘤血管內(nèi)皮細胞，所以，使用與白蛋白結(jié)合的EB作為示蹤物質(zhì)，根據(jù)EB是否穿過腫瘤血管壁進入到組織被廣泛用于評估血管通透性變化情況。本課題組前期實驗使用頻率為1 75 MHz、M1為l.4的超聲波聯(lián) 合0 2 rnlikg的“脂氟顯”超聲微泡輻照局部腫瘤組織5 min，可以明顯提高腫瘤組織的EB含量，說明了診斷超聲波介導的超聲微泡破裂可引起了血管腫瘤屏障的開放或損傷，從而使大分子物質(zhì)能夠穿過血管到達腫瘤組織中。 近年來，國內(nèi)外研究表明超聲治療儀通過發(fā)射超聲波介導的超聲靶向微泡破壞技術(shù)( UTMD)可通過提高腫瘤血管通透性，從而有效增加病變靶區(qū)的藥物有效治療濃度，或可成為提高腫瘤療效的新手段。湯慶等使用照射條件為頻率i 9 MHz，TIS 0 8，ISATA 80 rnW/cmz的超聲治療儀持續(xù)輻照5 mln．并經(jīng)尾靜脈輸入400 ul/kg的sonoVue超聲造影劑可增加腫瘤癌組織微血管通透性。Bekeredjian等發(fā)現(xiàn)使用頻率為1 3 MHz，MIl_6的診斷超聲聯(lián)合1 mL微泡輻照腫瘤15 min可明顯提高腫瘤癌微血管的通透性。文獻所報道應用UTMD技術(shù)進行實驗的參數(shù)各不相同，分析差異產(chǎn)生的原因可能因為：(l)發(fā)射超聲波的相應頻率不同，文獻研究發(fā)現(xiàn)不同頻率超聲波所引發(fā)的生物學效應完全不同，可能存在著聲壓閾值的不 同；(2)應用的超聲造影劑不同，可能使超聲強度與其產(chǎn)生的生物學效應形成一定的差異；(3)超聲波的輸出功率完全不同，文獻報道的超聲治療儀型號及品牌差異很大，輸出功率在瓦級水平，而本研究使用的臨床超聲診斷儀器輸出功率在毫瓦級，產(chǎn)生的生物學效應必然會完全不同lⅢ。對影響診斷超聲聯(lián)合微泡下產(chǎn)生生物學效應的相關(guān)因素進行研究，可以為下一步深入實驗及臨床研究提供可靠參數(shù)。
        基于此，本研究使用低頻診斷超聲聯(lián)合微泡對大鼠皮下移植瘤進行持續(xù)輻照，主要探索MI、超聲輻照時間、微泡劑量對腫瘤血管通透性的影響，從而為優(yōu)化低頻診斷超聲聯(lián)合微泡的影響參數(shù)提供實驗依據(jù)。 實驗部分主要探索不同MI對腫瘤血管通透性的作用。相關(guān)文獻表明引發(fā)超聲空化效應的強度與其所致的生物學敞應之間存在較好的相關(guān)關(guān)系，本實驗所使用的診斷超聲中使用機械指數(shù)(MI)這一指標反應超聲儀所引發(fā)的超聲強度，由于超聲波經(jīng)皮膚及軟組織后的聲衰減未納人相關(guān)測量計算中，面且根據(jù)超聲波在軟組織中傳播時聲壓與頻率及機械指數(shù)的關(guān) 系P—wn二√f所示聲壓與MI和頻率呈正比，故機械指數(shù)能否真正的反應所引發(fā)的超聲空化強度仍未可知。本實驗使用MI作為反應超聲輸出功率的主要指標，袁1顯示Ml≤0 8時EB的滲出量與對照組無明顯差異，當Ml≥0 8時隨著超聲能量的進一步提高，EB含量由M1—0 8時的(310±28. 31) ygig增加至MI-1-3時的(722. 6±54. 19) /c9/9，差異有明顯的統(tǒng)計學意義。

        通過本研究的結(jié)果說明，MI超過0.8時可明顯增加超聲的空化效應，隨著MI升高其所引起的血管通透性增加也越明顯，因為本實驗所使用S2000超聲診斷儀器在l_75 MHz條件下輸出大M1為l.3條件，未能對MI>l.3情況進行探索。 實驗第二部分主要探索不同等級超聲造影劑劑量對腫瘤血管通透性的作用。目前相關(guān)研究認為，在超聲場中注入微泡造影劑相當于加入超聲空化核，會使超聲空化效應閩值明顯降低，可達到增強空化作用的目的。本實驗中使用SonoVue超聲造影劑注人血液作為超聲空化核，表2顯示單純超聲輻照對腫瘤血管通透眭未產(chǎn)生明顯影響(與對照組相比P>0. 05)，在。-300 vUkg范圍內(nèi)，腫瘤組織EB含量隨微泡劑量成線性增加，由30 uUkg的(178. 6土29. 66) t/gjg增加到300 VUkg的(722 6±54 19) yg/g，當微泡劑量>300 FLUk9時EB含量增加不明顯，在此處曲線出現(xiàn)高劑量時的平臺現(xiàn)象，提示診斷超聲聯(lián)合微泡增加腫瘤組織中的EB劑量有佳劑量效應，當造影劑微泡劑量低于雖佳劑量時隨著劑量的增加血管通透性亦隨之增加，微泡劑量處于佳計量值時血管通透性也達到大程度，當微泡割量高于佳劑量時血管通透性不做相應增加，可能是因為超聲波穿過軟組織時散射和屏蔽效應只能和300 UUkg產(chǎn)生協(xié)同作用。

        實驗第三部分主要探索不同超聲輻照時間對腫瘤血管通透性的作用。表3顯示超聲輻照時間在10m-n范圍內(nèi)隨著輻照時間的延長，腫瘤組織中EB的滲出量呈線性增加，由l min的(368. 1±40. 99)vg/g增加到10 min的(722. 6±54. 19) ug/g，診斷超聲聯(lián)合微泡輻照腫瘤組織1 min時，即可使腫瘤組織中EB含量明顯增多(與對照組相比P<0. 05)，這是因為觸發(fā)聲孔效應所需的時間很短，l min時間內(nèi)即可引起超聲所致空化效應明顯增加，隨著超聲輻 照時間的延長，腫瘤組織中EB含量也隨之增多。當輻照時間超出iO min后EB含量增加緩慢，提示診斷超聲聯(lián)合微泡增加血液中EB滲出在10 min達到撮大水平，在此處曲線出現(xiàn)長時間輻照時的平臺現(xiàn)象，此后超聲輻照時間對通透性影響不大。可能是因為10 min后超聲造影劑經(jīng)過體內(nèi)代謝和超聲爆破作用后，殘留血管內(nèi)的數(shù)量有限，所產(chǎn)生空化效應不足以使血管通透性改變的原因所致。

        文獻報道影響超聲聯(lián)合微泡提高血管通透性的影響因素，包括造影劑劑量、超聲強度、遣影劑注射方式、超聲頻率、超聲輻照方式（持續(xù)輻照和間歇輻照，輻照時間為前次爆破后采用低機械指數(shù)實時造影觀察到再充盈時間）、超聲輻照時間等，同時各影響因素間還可能存在相互制約的關(guān)系，對其進行優(yōu)化可大程度提高腫瘤微血管通透性。在本研究中以大鼠 皮下移植肝癌模型作為實驗對象，在皮下移植瘤部位通過固定頻率為1 75 MHz的高機械指數(shù)診斷超聲波刑咀“團注”方式注射進入血管的SonoVue超聲造影劑進行持續(xù)靶向破壞，以EB在腫瘤組織的滲出量作為考察腫瘤微血管通透性的指標，分別考察了超聲造影劑劑量、輻照時間、超聲輻照強度即輸出機械指數(shù)對腫瘤血管通透性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤組織血管 通透性的增加隨著超聲輻照時問、造影劑劑量以及Ml增加而增加的，當輻照時間超過10 min或造影劑劑量超過300 Vlikg時，腫瘤組織中EB含量增加不明顯。 
        本實驗研究結(jié)果表明診斷超聲介導的UTMD技術(shù)可顯著提高腫瘤微血管通透性，超聲輻照時間、造影劑劑量以及MI均為影響此技術(shù)的主要因素，但仍存在許多問題亟待解決。首先，本實驗僅對診斷超聲靶向破壞微泡條件下腫瘤血管通透性進行定量評估，但藥物或基因只有作用于病變部位的細胞水平才能發(fā)揮其應有曲治療作用，對治療效果進行評估可為此技術(shù)應用于臨床提供更為精確的結(jié)果。

        其次，我國原發(fā)性肝癌多伴有乙肝、肝硬化等前期病變，肝臟腫瘤局部部位血竇會發(fā)生“毛細血管化”并有周圍肝組織纖維化的發(fā)生，本實驗僅探索低頻診斷超聲靶向破壞微泡對皮下移植腫瘤血管通透性的影響，對肝纖維化、肝硬化病變時血管通透性影響還需進一步研究。

        結(jié) 論

        低頻診斷超聲在超聲頻率為1 75 MHz、M1為1 3、輻照時間為IO min參數(shù)下聯(lián)合300pVkg的SonoVue超聲造影劑對腫瘤組織進行持續(xù)輻照可以攝犬程度的安全、有效地增加腫瘤血管通透性，超聲輻照時間、MI、造影劑劑量均為影響UTMD技術(shù)提高血管通透性的主要因素，可為進一步研究低頻診斷超聲聯(lián)合微泡實施靶向給藥治療提供實驗基礎(chǔ)。