庫爾特原理發(fā)展史

        血液分析儀。目前此行業(yè)非常興旺，有好幾個公司參與其中。 
        階段

        通過在其它地方獲得了技術(shù)經(jīng)驗后，華萊士于1946年回到了芝加哥，此后他邀請了其兄弟小約瑟夫·R. 庫爾特（圖2）加入他的研究。他后來回憶了他們在一個地下室實驗室中的工作：3 “開始的方法是對向下經(jīng)過毛細(xì)管、通過一條光束的血細(xì)胞計數(shù)，就像統(tǒng)計正走下走廊的人們的人數(shù)一樣。但我們沒有獲得非常好的感測信號，我們問自己這是為什么。除了調(diào)節(jié)光束的方法外，是否有其它方法由細(xì)胞的通過動作產(chǎn)生電脈沖信號？”盡管當(dāng)時我們不知道答案，但血細(xì)胞是絕緣體 – 因此我們通過調(diào)節(jié)電流而不是調(diào)節(jié)光束，而獲得了解決方案。 通過一項本質(zhì)上簡單的解決方案，華萊士在1947年已經(jīng)將毛細(xì)管的長度降到了低。1“在我們開始時，我們沒有多少錢，我們在煙盒上取下的一張玻璃紙上，用加熱的針刺了一個小孔。　雖然這種小孔維持不了多久，但我們對一些細(xì)胞進(jìn)行了計數(shù)。”刺有小孔的玻璃紙通過橡膠圈固定覆蓋在玻璃管的末端之上，并將連接在電源上的兩個電極分開，懸浮在離子介質(zhì)中的細(xì)胞和電流儀器流過刺有小孔的玻璃紙。一個細(xì)胞在此小孔中的液體排水量（等于其自身體積），與傳導(dǎo)電流流經(jīng)此小孔的兩個電極之間的電壓脈沖成正比。 
        庫爾特兄弟發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞和懸浮介質(zhì)之間的電反差，是通過光電方法獲得的電反差的10倍，通過所產(chǎn)生的電壓脈沖可非常容易地對流經(jīng)小孔的懸浮液中的細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù)。這項發(fā)現(xiàn)促使華萊士不惜花了非常長的時間來尋找一位愿意代辦專利權(quán)申請的律師。后在1948年，有人介紹了Irving Silverman給他，后者認(rèn)可了此項具有重大潛力的新方法。1949年，提交了專利權(quán)申請。 
        但專利權(quán)審查人員也懷疑是否可對一個孔能授予專利。幸運的是，他猜想如果可以提供一些應(yīng)用例子（而不僅僅提供“通過小孔的軸向電流和感測通道”這一原理），在對狹小電流通道中的粒子進(jìn)行感測的原則基礎(chǔ)上，可以獲得專利。1 對橫穿小孔中懸浮液流的模擬通道進(jìn)行了描述，還描述了具有非圓形橫截面的小孔。一根絕緣的針?biāo)褜し€(wěn)定懸浮液中經(jīng)過的粒子是另外一個例子；一個粒子的存在，是通過移動的針和接觸導(dǎo)電懸浮介質(zhì)的另一個電極之間電流中的脈沖來感測的。因此這樣定義了新的庫爾特原理，在50年前的1953年10月20日，授予了具有開創(chuàng)性的專利權(quán)，在試管的內(nèi)壁較低處形成的極微小孔為專利首先的實例。 
        同時，庫爾特兄弟繼續(xù)進(jìn)行研發(fā)，重點在于使自動化變得可行。在Walte Hogg（約瑟夫在服役時的朋友）的無償幫助下，庫爾特兄弟組裝了一臺實驗性儀器（與海軍研究局簽訂的合同項目）：一個機械測量系統(tǒng)驅(qū)動受控制的一定量的細(xì)胞懸浮液流過小孔，同時一個連接器件向其提供電流，并通過具有可調(diào)閥值的電壓放大器感測所產(chǎn)生的信號脈沖。超過閥值的信號脈沖會觸發(fā)安裝在連接器件頂部的脈一個沖計數(shù)器（Berkeley科學(xué)模型410；貝克曼儀器公司，[當(dāng)時]在加州里士滿）。通過連續(xù)增加閥值，對樣本重復(fù)進(jìn)行測試，可人工記錄細(xì)胞大小的累積分布。由于需要監(jiān)測小孔是否部分組塞，因此加裝了一臺示波鏡，可以同時監(jiān)測信號脈沖和閥值的設(shè)定。 
        1956年華萊士其個人技術(shù)論文中正式宣布了庫爾特原理。7 “在新的計數(shù)器中，讓單個細(xì)胞穿過懸浮液中一個小的狹窄電流通路，然后檢測細(xì)胞和懸浮液各自導(dǎo)電性的差別。一個小的狹窄電流通路和光學(xué)系統(tǒng)中的一小束光線類似。在通過液體中小的電流路徑時，單個血細(xì)胞改變了電路中的電阻，使得穿過電流通路后電壓的下降發(fā)生了變化。小規(guī)模的電流通路和流過通路的含有細(xì)胞的液體流都具有簡單的結(jié)構(gòu)。電流通路的邊界就是一個絕緣容器內(nèi)壁上尺寸很小的潛孔口。” 在圖3中，該潛孔口即是帶孔圓片A上中心孔。 
        此后不久，出版了兩份美國國立衛(wèi)生研究院的評估報告。8,9 兩份報告都認(rèn)為庫爾特方法在給紅細(xì)胞計數(shù)時提高了準(zhǔn)確性、有效性和方便性?？銎渲幸环菰u估報告的期刊同時也做了新的庫爾特計數(shù)器®的份廣告。另一份評估報告9 認(rèn)為粒度分布上的偏斜度是細(xì)胞重合造成的，并提供了一種糾正重合造成的計數(shù)損失的人工方法。它還包含了白細(xì)胞計數(shù)的初步數(shù)據(jù)。 
        自動進(jìn)行重要血液測試工作的可行性已經(jīng)得到證明，但商業(yè)化運作還未展開。牢固地固定小孔的工作還很困難。10 壓力計（用來測量通過小孔后懸浮物）中使用的水銀也是需要顧慮的事情，實驗性計數(shù)器中的機械系統(tǒng)就顯得尤為重要 。用來為小孔提供激勵電流的電壓源對小孔以及用來懸浮細(xì)胞的介質(zhì)的特征，都會產(chǎn)生無法接受的靈敏度。在美國國立衛(wèi)生研究院開展的研究中，已經(jīng)確認(rèn)需要自動稀釋計來精確地稀釋樣品。13 約瑟夫后來總結(jié)這十年來的準(zhǔn)備工作時說，“我們知道還有很多問題，但是我們已經(jīng)知道了一些有用的東西。”下一個十年就要開始了，很快在新申請的專利中都會有這些問題的解決方法。 
        第二階段

        庫爾特計數(shù)器的核心是感測小孔（見圖3，圓片A上的小孔），它這時得到了庫爾特兄弟多的關(guān)注。對于許多潛在的應(yīng)用來說，要求小孔直徑小于100 lm，允許的尺寸和形狀容差都很小。樣品試管壁上直接做成的小孔可重復(fù)性低， 這樣就促使對玻璃帶孔圓片（形成毛細(xì)管的橫截面）進(jìn)行實驗。但是用來固定圓片的接合劑沒有成功（無效），且如果將下孔焊接在樣品試管上，熱量會使得小孔扭曲變形。還試用了用作表軸承的環(huán)寶石，Hermann Foery（瑞士珠寶公司，位于瑞士洛迦諾市）提供了實驗用的寶石，用其做成了早期低噪聲小孔。與Sam Gutilla（美國伊利諾斯州芝加哥市Del Mar Scientific公司）合作，開發(fā)出一種將寶石焊接到樣品試管上的方法。寶石上精確的柱狀小孔不受焊接的影響，并為電流的流動和樣品懸浮液提供了持久耐用的管道。 到1958年底，對焊接有環(huán)寶石的可互換樣品試管（見圖3中的B）的提出了專利申請。10 所選寶石的厚度可以提供小孔長度直徑比約為0.75，這樣可以盡量減少基本專利4和美國國立衛(wèi)生研究院研究9中提到的微粒重合現(xiàn)象。到了1958年，庫爾特兄弟已經(jīng)準(zhǔn)備好創(chuàng)立庫爾特電子公司，以及庫爾特銷售公司。母公司早的兩名全職員工是長期提供義務(wù)服務(wù)的小約瑟夫 R.庫爾特和沃爾特·豪格（Walter Hogg）。庫爾特兄弟的父親初只是周末到公司來做兼職的秘書和會計工作，但此時他已經(jīng)68歲了，他從鐵路報務(wù)員的崗位上退休，和他的兒子們一起工作，一直到1971年才部分退休。沃爾特是個在公司工作達(dá)20年之久的員工，指定其為發(fā)明人的美國專利比指定華萊士為發(fā)明人的美國專利還多一些（各為95項專利和82項專利），沃爾特也是公司內(nèi)比華萊士擁有更多專利的員工。 
        事后看來，1958年是一個重要的起點。Kilby發(fā)明了振蕩器——個集成電路。很快地，Noyce和Hoerni開發(fā)出平面工藝，使得微電子迅猛發(fā)展。Townes和Schawlow描述了微波激射器在光學(xué)頻率上工作的要求，在兩年后，Maiman發(fā)現(xiàn)了激光。所有這些發(fā)展都為新公司的未來起到了舉足輕重的作用。 
        開始時由Ernie Yasaka組裝原型的復(fù)制品14，也就是現(xiàn)在所說的A型庫爾特計數(shù)器®，由華萊士進(jìn)行銷售。為了可用于工業(yè)目的15 ，在樣品臺上添加了一個攪拌器（見圖4）。新公司立即需要關(guān)注的是一篇論文證實脈沖幅度和顆粒體積之間有正相關(guān)關(guān)系。通過將一個庫爾特計數(shù)器®和具有雙可變脈沖閾值的單通道脈沖－高度分析器（PHA）進(jìn)行連接，Kubitschek獲得了個微分粒度分布；這樣就凸顯出A型計數(shù)器的兩個缺點：，它單一的閾值需要通過連續(xù)增加閾值進(jìn)行多次樣品測試來獲得累積粒度分布14,16，而且需要大量的時間和計算來人工獲得微分粒度分布。很明顯，非常需要自動化方法進(jìn)行粒度分析；第二個缺點是，用于提供小孔電流的電壓源使得脈沖幅度對于特定小孔的大小、特定懸浮介質(zhì)的電阻系數(shù)以及特定懸浮介質(zhì)中溫度引起的變化都很敏感14,15，這些都使精確計數(shù)和粒度分析變得復(fù)雜。 
        在白細(xì)胞計數(shù)上取得了良好的成果后17，公司在1960年引進(jìn)了一種改進(jìn)的儀器18 ，旨在進(jìn)一步對細(xì)胞和顆粒大小進(jìn)行精確的測量。使用電流源對小孔進(jìn)行激勵代替了原來的電壓源，而用來感測顆粒脈沖的雙閾值電流靈敏放大器代替了原來的單閾值電壓放大器。因此，B型庫爾特計數(shù)器對限制A型計數(shù)器的那些因素不敏感，它的雙閾值聯(lián)鎖，形成了一種可移動的通道，由定序四秒計時器來控制。它附屬的H型分布繪圖儀20可以從100秒樣品運行中自動累計25個通道的微分粒度分布18。C型庫爾特計數(shù)器的開發(fā)也取得了進(jìn)展——它的原型包括12通道的脈沖－高度分析器。它的350多個真空管可以給公司的設(shè)施供暖，它的體形巨大，搬運時需要拆開。到1961年，當(dāng)公司從芝加哥搬到佛羅里達(dá)州的Hialeah時，C型庫爾特計數(shù)器已經(jīng)小到可以放在桌面上了。 
        20世紀(jì)60年代，在紅細(xì)胞和白細(xì)胞7,18,22–28的計數(shù)和大小測量上，A型和B型計數(shù)器都證明很有用（見評論25,27），而且在微生物學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域粒度分析上也獲得了應(yīng)用31 。但同時，也產(chǎn)生了擔(dān)憂。1959年，按照庫爾特原則設(shè)計了一種商用型儀器。32 1960年，美國國立衛(wèi)生研究院研究中9所發(fā)現(xiàn)的非對稱分布得到了證實。笨重的稀釋器促使一位客戶自己設(shè)計更好用的儀器22。1962年，發(fā)現(xiàn)感測小孔的長度直徑比影響粒度分析的分辨率。34 一家公司（后來成為庫爾特兄弟公司的競爭對手）就庫爾特原則的一種衍生模式35申請了專利，而庫爾特銷售公司的一名主管自己也申請了一種衍生樣品管的專利36，他后來離開了庫爾特公司，也成為了庫爾特公司的競爭對手37。此外，早期的血小板計數(shù)實驗也遇到了沒有預(yù)想到的干擾，干擾顯然來自相位顯微鏡無法發(fā)現(xiàn)的小顆粒38。 Lushbaugh等人將100通道的PHA和A型庫爾特計數(shù)器39,40連接在一起，提高了測量的成本。很快，幾家公司都把為特定目的制作的庫爾特顆粒感測器和商用型PHA連接在一起，可以提供多達(dá)512個通道29。體積測量工具的可用性和復(fù)雜度越來越高，使得在測量各種細(xì)胞和顆粒的粒度分布上，使用人工工具越來越明顯1。華萊士這樣評論說，“面臨挑戰(zhàn)也很好，我們肯定能夠分享一部分好處。” 
        第三階段 
        感測小孔（見圖3帶孔圓片上的小孔）是庫爾特原理的核心，設(shè)計一個庫爾特計數(shù)器，自動彌補其功能特點上的不足，現(xiàn)在成為首要任務(wù)。美國國立衛(wèi)生研究院的研究注意到，感測小孔的敏感量是幾何小孔的三倍，這是激勵電流流過樣品容器和樣品管中懸浮介質(zhì)所產(chǎn)生的電場的結(jié)果（見圖3）。量測系統(tǒng)產(chǎn)生的類似水動力場使得細(xì)胞（或粒子）通過感測小孔時，細(xì)胞（或顆粒）和電場產(chǎn)生相互作用。對于兩種小孔場來說，重要的顆粒相互作用是發(fā)生在包含感測小孔的敏感體積內(nèi)，而且從小孔入口和出口處成半橢圓形向外延伸到三到四倍小孔直徑的距離處。 
        因此，通過排出和細(xì)胞相同體積量的導(dǎo)電懸浮媒介，每個細(xì)胞在它的范圍內(nèi)扭曲了電場——特別是在通過感測小孔時。結(jié)果是，細(xì)胞的體積和小孔的相當(dāng)。小孔電阻的變化（通常是50,000分之一），以及通過小孔時帶來的電阻的細(xì)小變化，產(chǎn)生了信號脈沖，這樣就能夠進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和測量大小。要達(dá)到精確的計數(shù)和可重復(fù)的大小量測，要求通過小孔的懸浮流非常平穩(wěn)。 
        和離子電流不同，由于懸浮介質(zhì)的聚集和黏性，懸浮液流受到感測小孔表面慣性和邊界層的影響。結(jié)果是，這些對小孔和它的兩個孔口產(chǎn)生微幾何學(xué)反應(yīng)50 ，在小孔軸心中點周圍產(chǎn)生不對稱的動力流場。在出口孔洞產(chǎn)生的環(huán)型流體將顆粒帶回小孔的感測體積內(nèi)，這樣會產(chǎn)生二次脈沖，導(dǎo)致錯誤的顆粒計數(shù)結(jié)果。例如，沃爾特·豪格在一次早期的血小板研究中發(fā)現(xiàn)38，所遇見的假微粒是那些重新進(jìn)入感測體積內(nèi)的紅細(xì)胞，二次脈沖使它們重新被計作血小板。將顆粒從出口孔帶走的輔助流可以防止顆粒循環(huán)和二次脈沖。 
        一直認(rèn)為同時通過小孔敏感體積的細(xì)胞通過屏蔽顆粒脈沖會減少細(xì)胞計數(shù)4,7，但計數(shù)上的損失可以通過懸浮液中細(xì)胞濃度從統(tǒng)計學(xué)角度預(yù)測出來9,52–60。因此，單通道計數(shù)可以通過合適的電路自動糾正61，新一個版本的D型庫爾特計數(shù)器介紹了這一方法。然而，同時通過的顆粒產(chǎn)生的非典型脈沖還導(dǎo)致了粒度分布變寬45，典型紅細(xì)胞粒度分布出現(xiàn)不對稱39–41,44,62。在美國國立衛(wèi)生研究院的研究中9把這種不對稱歸為粒子重合，但很快在其它細(xì)胞類型38和粒子的粒度分布中也發(fā)現(xiàn)了這種不對稱31,63,64。在提高測定體積的準(zhǔn)確性后，紅細(xì)胞的粒度分布被證實呈雙峰性40,41,65。這些分布假象都造成尺寸測量的分辨率降低。 
        到20世紀(jì)60年代后期，與體積測定產(chǎn)生假象的原因有關(guān)的研究迅速發(fā)展28,30,44,45,49,65–78，幾個研究單位根據(jù)庫爾特原理建立起實驗系統(tǒng)。顆粒以離軸不同的徑向距離通過感測小孔時，會出現(xiàn)麻煩的粒度分布假象。在低有效顆粒濃度下，長度是直徑幾倍的小孔可以提高測量分辨率34,41,67,80，圍繞一個更小懸浮液流的輔助流可以水動力方式將通過小孔的顆粒集中在軸附近。在典型的顆粒濃度下，在小孔中心點對信號脈沖抽樣，或者按照持續(xù)時間對信號脈沖進(jìn)行選擇，可以大大提高體積測定的精確度（見概覽65,67,78,86–88）。 
        對小孔功能特性進(jìn)行研究的一個重要結(jié)果就是發(fā)明了個細(xì)胞分類器48,70,89–91，它可以判斷紅細(xì)胞雙峰分布是事實還是假象。Fulwyler將庫爾特原理和噴墨技術(shù)相結(jié)合，并使用該成果將細(xì)胞從單一的分布模式中挑選出來。當(dāng)挑選出來的紅細(xì)胞被重新測定大小后，結(jié)果表明原來的雙峰形式是一種假象。 
        在這次研究大發(fā)展中，庫爾特計數(shù)器的型號隨著電子學(xué)的發(fā)展而發(fā)展，裝有晶體管的F型和C型同時替代了A型。樣品臺進(jìn)行了改裝，J型分布繪圖儀代替了H型分布繪圖儀。1968年下半年，出現(xiàn)了個自動化的血液分析計94——7個參數(shù)的S型庫爾特計數(shù)器®。同時，裝有晶體管的T型庫爾特計數(shù)器®代替了C型庫爾特計數(shù)器®，用于工業(yè)目的。在集成電路的基礎(chǔ)上，1970年推出了Z系列計數(shù)器。1972年出現(xiàn)了Channelyzer®體積分析儀，同時還出現(xiàn)了工業(yè)用TA系列分析儀，它包含了計數(shù)器和16通道PHA電路。隨后不久，這些儀器都開始采用微處理器。 
        華萊士經(jīng)常評論說1，“只要它是有用的，人們就會購買。”隨著產(chǎn)品的不斷改進(jìn)，銷售量也越來越大。
        2000年以后出品的Multisizer系列在工業(yè)、生物等各領(lǐng)域具有不可替代的地位，源自于該型號具備極高的分辨率，并可依據(jù)其新開發(fā)的DPP處理器，單獨分析個體顆粒的脈沖信號，使得對測量全過程顆?；蚣?xì)胞的體積或粒徑的變化的監(jiān)控成為可能。該脈沖處理器的技術(shù)的誕生也使得粒度分析儀領(lǐng)域添加了一項的過程監(jiān)控功能。