流式細胞胞儀的分析及分選原理

         流式細胞儀由液流系統(tǒng)、光學與信號轉(zhuǎn)換測試系統(tǒng)和數(shù)字信號處理及放大的計算機系統(tǒng)三大基本結(jié)構(gòu)組成。在對細胞懸液中的單個細胞或其超微結(jié)構(gòu)進行多參數(shù)快速自動分析過程中，每秒鐘能測量數(shù)千個至數(shù)萬個細胞，能在分析過程中按實驗設(shè)計要求對特定細胞進行分析，帶細胞分選系統(tǒng)的流式細胞儀還可按實驗設(shè)計要求分選出具相同特征的同類型細胞，用于培養(yǎng)或進一步研究。

         一、工作原理 流式細胞儀的工作原理借鑒了熒光顯微鏡技術(shù)，將熒光顯微鏡的激發(fā)光源改為激光，使其具有了更好的單色性與激發(fā)效率，同時利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展，提高了檢測的靈敏度和特異性，并將固定的標 本臺改為流動的單細胞懸液，用計算機進行光信號的數(shù)據(jù)處理分析，提高了檢測速度與統(tǒng)計分析的精確性能。能同時從一個細胞上獲取多種參數(shù)資料。

         (一)基本組成結(jié)構(gòu)
         1．液流系統(tǒng) 
         由樣本和鞘液組成。待測細胞被制備成單個細胞懸液，經(jīng)熒光染料標記的單克隆抗體染色后置入樣品管中，在清潔氣體壓力下進入流動室形成樣本流；鞘液是輔助樣本流被正常檢測的基質(zhì)液，其主要的作用是包裹在樣本流的周圍，使其保持處于噴嘴中心位置以保證檢測精確性，同時又防止樣本流中細胞靠近噴孔壁而堵塞噴孔。細胞懸液進入鞘液中的孔徑通常 為 50～300μm孔徑。

         2．光學系統(tǒng) 
         由激光光源、分光鏡、光束成形器、透鏡組和光電倍增管組成。

         (1)激光光源：現(xiàn)代流式細胞儀采用的多為氣冷式氬離子激光器；

         (2)分色反光鏡：作用是反射較長波長的光，通過較短波長的光。

         (3)光束成形器：由兩個十字交叉放置的圓柱形透鏡組成，作用是將激 光器發(fā)射的激光束聚焦成高 15μm，寬 57 μm的橢圓光斑。

         (4)透鏡組：有三個透鏡，作用是將激光和熒光變成平行光，同時除去離散的室內(nèi)光。

         (5)濾片：長通濾片一允許長于設(shè)定波長的光通過；短通濾片一允許短于設(shè)定波長的光通過；帶通濾片一允許一定帶寬的波長通過，其他波長的光不能通過，有 525 nmBP，575 nmBP，620 nmBP，675 nmBP 4 個。

         (6)光電倍增管(pholomultiplier tube，PMT)：由 FS，SS，F(xiàn)Ll，F(xiàn)L2， FL3，F(xiàn)IA 組成，主要作用是檢測熒光和散射光，同時將光學信號轉(zhuǎn)換成電脈沖(數(shù)字數(shù)據(jù))信號。當調(diào)整 PMT 電壓，脈沖信號也發(fā)生改變。

         3．數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 主要由計算機及其軟件組成。能對實驗分析數(shù)據(jù)的存儲、顯示和分析更加智能化和自動化，是流式細胞儀組成部件中的重要環(huán)節(jié)。

         (二)基本工作原理
         按檢測需要標記了特異性熒光染料的單細胞懸液和鞘液，分別經(jīng)硅化管進入流動室，形成鞘液包裹細胞懸液的穩(wěn)態(tài)單細胞液柱，該液柱以穩(wěn)定的層流形式通過噴嘴高速射下，液柱與水平方向的高度聚焦的激光束垂直相交，單個細胞上標記的熒光染料在通過激光光斑時被激發(fā)而產(chǎn)生特異性熒光，同時，由于混合細胞群中細胞大小和胞內(nèi)顆粒的多少會被激發(fā)而產(chǎn)生不同的散射光。在入射光束與液柱垂直的方向有熒光檢測系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)，用于收集熒光信號和側(cè)向散射光信號，前向散射光感受器在前向小角探測接受前向光信號。被接收的光電信號被光電倍增管轉(zhuǎn)換成電壓脈沖和積分脈沖，使信號放大，該信號進入計算機系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，儲存，分析，處理，按不同的檢測設(shè)計采用相應(yīng)軟件程序?qū)Y(jié)果進行綜合分析，并以圖像和數(shù)據(jù)顯示于熒光屏上，包括了單參數(shù)和二維或三維圖像資料，陽性細胞百分率，x±s，斜率，峰值，峰面積等多參數(shù)資料。一臺好的流式細胞儀每秒可測量 15 000 個細胞，測定 1 000 個熒光染料分子的粒子，這是目前其他儀器尚無法做到的。