化合物OCAM的體外抗腫瘤活性

    作者：柳旺艷,李娟,李巖,劉東艷,李靜　　作者單位：吉林大學公共衛(wèi)生學院，吉林長春

    腫瘤的化學藥物治療是一種全身性治療，在腫瘤綜合治療中占有很重要的地位，雖然目前已有許多抗腫瘤藥物用于臨床，對大多數(shù)腫瘤也有一定療效，但仍然存在治療效率不高、選擇性差、毒副反應(yīng)大及瘤細胞耐藥等問題。尋找高效、低毒、特異的抗腫瘤藥物仍是腫瘤藥物治療的重要課題。本文采用體外實驗方法探討金剛烷胺修飾物OCAM的體外抗腫瘤活性，為其進一步應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗藥物

　　金剛烷胺修飾物OCAM由吉林大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗教研室提供。

　　1.2 細胞株

　　人肝癌SMMC7721細胞、小鼠H22肝癌細胞和HL7702人肝細胞均為吉林省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供。

　　1.3 試劑

　　RPMI1640培養(yǎng)液(GIBCO公司);胎牛血清(GIBCO公司);胰蛋白酶(DIFFICO公司);甲基偶氮唑藍([3(4,5)dimethylthiazol2nyl]2,5diphenyltetrazoliumbromide，MTT，AMRESCO分裝);氟尿嘧啶(5Fu，上海旭東海普藥業(yè)有限公司)。

　　1.4 方法

　　1.4.1 MTT法檢測OCAM對HL7702人正常肝細胞的毒性

　　將傳代后第2天處于對數(shù)增殖期HL7702細胞，用含50mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液制成單細胞懸液，細胞以1×105個/孔的密度接種于96孔板，每孔中分別加入細胞懸液100μL，在體積分數(shù)50mL/L CO2，37℃，飽和濕度下培養(yǎng)24h后，實驗組以100μL/孔加入質(zhì)量濃度分別為750mg/L、500mg/L、250mg/L、100mg/L、50mg/L的化合物OCAM;陽性對照組和空白對照組分別加入100μL/孔5Fu(100mg/L)和RPMI1640培養(yǎng)液，每組設(shè)6個復孔，在570nm波長下用酶標儀測定吸光度(absorbance, A)，計算細胞毒百分率，用相應(yīng)軟件計算得出半數(shù)毒性濃度(mediallethaldose, TC50)。

　　1.4.2 MTT法檢測OCAM對SMMC7721人肝癌細胞的抑制作用

　　按1.4.1方法檢測質(zhì)量濃度分別為200mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L、12.5mg/L的OCAM對SMMC7721人肝癌細胞的抑制作用，計算藥物對腫瘤細胞抑制率(inhibitionrate, IR)，用相應(yīng)軟件計算得出半數(shù)抑制濃度(50% inhibitingconcentration, IC50)。

　　1.4.3 臺盼藍染色法檢測OCAM對H22腫瘤細胞的抑制作用

　　將H22腫瘤細胞調(diào)至1×105個/mL，以0.05mL/孔接種于24孔板上，然后實驗組加入0.05mL/孔化合物OCAM(質(zhì)量濃度分別為1000mg/L、500mg/L、100mg/L、50mg/L);陽性對照組和空白對照組分別加入0.05mL/孔5Fu(100mg/L)和RPMI 1640培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復孔。作用24h后，用4g/L臺盼藍染液染色，在顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞數(shù)和死細胞數(shù)，計算抑制率。

　　1.4.4 SMMC7721腫瘤細胞集落形成實驗

　　將SMMC7721腫瘤細胞1500個/孔接種于6孔板。培養(yǎng)24h后依次加入2.0mL/孔化合物OCAM(質(zhì)量濃度分別為750mg/L、500mg/L、250mg/L);陽性對照組和空白對照組分別加入2.0mL/孔5Fu(250mg/L)和RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)2周，加入甲醇固定經(jīng)姬姆薩應(yīng)用液染色，空氣干燥后在顯微鏡下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)，計算集落抑制率。

　　1.4.5 SMMC7721腫瘤細胞凋亡及細胞周期分析

　　將SMMC7721腫瘤細胞懸液調(diào)濃度至6×105/mL。取24孔平底培養(yǎng)板，每孔加入細胞懸液500μL，CO2孵箱中孵育16h，將化合物OCAM以25mg/L、50mg/L的質(zhì)量濃度0.5mL/孔依次加入24孔板，空白對照組加入培養(yǎng)液0.5mL/孔，每組5復孔，同樣條件下培養(yǎng)48h，取單細胞懸液，用Hanks液離心洗滌2次，每次1000r/min，5min，調(diào)細胞濃度為2×106/mL，取1mL細胞懸液，加入等體積RNA酶，37℃消化30min，再加入等體積PI染液，4℃染色30min，用流式細胞儀測定，ModiFit軟件分析細胞周期。

　　1.5 統(tǒng)計學處理

　　數(shù)值變量結(jié)果以±s表示。應(yīng)用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

　　2 結(jié)果

　　2.1 MTT法檢測OCAM的細胞毒性和抑瘤效應(yīng)

　　由表1、表2可見，當OCAM劑量達到250mg/L時，OCAM對HL7702人正常肝細胞開始出現(xiàn)毒性作用(P<0.05)，抑制率為19.87%，半數(shù)毒性濃度TC50=616.68mg/L。當劑量為12.5mg/L時，OCAM即對SMMC7721肝癌細胞產(chǎn)生殺傷作用(P<0.05)，抑制率為7.49%。當劑量達到200mg/L時，OCAM對SMMC7721肝癌細胞的抑制率達到70.99%，半數(shù)抑制濃度IC50=87.11mg/L。表1 OCAM對HL7702人正常肝細胞的體外抑制作用(略)表2 OCAM對 SMMC7721腫瘤細胞的體外抑制作用(略)

　　2.2 臺盼藍染色法檢測OCAM對H22腫瘤細胞的抑瘤效應(yīng)

　　用臺盼藍染色法檢測化合物 OCAM 對小鼠肝癌H22細胞的殺傷作用。當劑量達到100mg/L時，化合物 OCAM即對H22腫瘤細胞產(chǎn)生殺傷作用(P<0.05)，抑制率為47.49%(表3)。表3 OCAM對H22腫瘤細胞的體外抑制作用(略)

　　2.3 SMMC7721 腫瘤細胞集落形成實驗

　　當劑量達到 250mg/L時，化合物 OCAM對SMMC7721肝癌細胞的集落形成抑制率為98.65%;劑量達到500mg/L時，集落形成抑制率達到(表4)。表4 OCAM對SMMC7721腫瘤細胞的集落形成抑制作用(略)

　　2.4 細胞凋亡和細胞周期分析

　　與空白對照組比較，實驗組細胞G0/G1期比例明顯增加，由52.88%增至61.82%和75.76%，且隨給藥劑量增加，G0/G1期比例增大?？瞻讓φ战M的腫瘤細胞凋亡率為5.93%，而實驗組的腫瘤細胞凋亡率分別為21.68%和20.05%，均有增大(圖1)。

　　3 討論

　　體外實驗篩選化合物的抗腫瘤活性，是抗腫瘤藥物研發(fā)中的重要步驟，具有操作簡便、用藥量少、實驗周期短等優(yōu)點。目前主要有美藍法、細胞拒染法、細胞還原法(MTT)、熒光測定法、化學發(fā)光法、同位素釋放法等篩選方法。MTT法檢測細胞增殖具有簡單、快速、高效、靈敏、重復性高等特點，廣泛用于體外腫瘤的藥敏測定[12]。其原理是MTT可透過細胞膜進入細胞內(nèi)，而活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將外源性MTT還原為難溶于水的藍紫色的甲臜(Formazan)結(jié)晶并沉積在細胞中，結(jié)晶物被二甲基亞砜溶解，通過檢測其吸光度值的改變可判斷細胞的活性，了解藥物的保護作用，從而進行藥效的定量分析[34]。金剛烷胺是飽和三環(huán)癸烷的氨基衍生物，是早用于抑制流感病毒的抗病毒藥[56]。有研究顯示，美金剛胺(memantine)作為Ⅳ甲基D天冬氨酸鹽(Nmethy1 D.aspartate, NMDA)受體拮抗劑可能對神經(jīng)組織的腫瘤生長有抑制作用[7]。金剛烷胺類化合物結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定性好，本課題組近年來已合成了多種金剛烷胺修飾物，對其抗腫瘤作用進行了篩選。本實驗采用MTT法和臺盼藍染色法測定了化合物OCAM在不同濃度和作用時間下對人肝癌細胞SMMC7721和小鼠肝癌細胞H22的抑制作用，結(jié)果表明OCAM從25mg/L到200mg/L的濃度范圍內(nèi)對人肝癌細胞SMMC7721都表現(xiàn)出明顯的抑制作用(P<0.01)，高抑制率達到70.99%，半數(shù)抑制濃度IC50為87.11mg/L。OCAM濃度為100mg/L時，即對H22腫瘤細胞產(chǎn)生殺傷作用，抑制率為47.49%。提示OCAM在體外有較好的抗腫瘤活性。用MTT法檢測化合物OCAM對人正常肝細胞HL7702的細胞毒作用，結(jié)果顯示OCAM在濃度為100mg/L時對于人正常肝細胞HL7702已無明顯毒性抑制作用，100mg/L 5Fu對人正常肝細胞HL7702卻達到34.54%，OCAM的半數(shù)毒性濃度TC50為616.68mg/L。減少對正常細胞的毒作用，提高抗腫瘤藥物殺傷作用的選擇性一直是抗腫瘤藥物研究中的一項重要指標，本實驗結(jié)果提示與5Fu相比較，化合物OCAM具有較好的選擇性殺傷腫瘤細胞作用。

　　集落形成實驗是反映單個細胞增殖潛力的一種較靈敏的檢測法[8]。惡性腫瘤組織中的克隆原細胞具有無限制的增殖能力，在體外培養(yǎng)中單個克隆原細胞可形成集落。它與腫瘤的治愈、復發(fā)或轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，是放射治療及抗癌藥物治療的靶細胞。本研究中OCAM在較小劑量(250mg/L)時，對SMMC7721肝癌細胞的集落形成抑制率就達到98.65%，OCAM劑量為500mg/L時，集落形成抑制率達到，可見其對SMMC7721腫瘤細胞的增殖有較強的抑制作用。

　　本研究通過流式細胞術(shù)檢測SMMC7721腫瘤細胞的細胞周期，結(jié)果顯示化合物OCAM組G0/G1期比例均明顯高于對照組，提示OCAM可能通過阻滯腫瘤細胞于G0/G1期，抑制腫瘤細胞的增殖速度，而達到抗腫瘤的目的。

　　綜上所述，金剛烷胺修飾物OCAM具有較好的體外抗腫瘤活性，對腫瘤細胞的殺傷作用具有一定的選擇性，有可能開發(fā)成為一種新型的抗腫瘤藥物。