骨髓增生異常綜合征患者線粒體DNA Dloop區(qū)突變研究

作者：靳紅,叢雅琴,胡曉靜,姜育杰　　作者單位：山東大學(xué)齊魯醫(yī)院血液內(nèi)科， 濟南 250012

　　【關(guān)鍵詞】骨髓增生異常綜合征,DNA,線粒體,突變;單核苷酸多態(tài)性

　　To investigate mitochondrial DNA mutation in myelodysplastic syndromes. Methods The mtDNA of 42 patients with myelodysplastic syndromes was extracted from both bone marrow and buccal epithelial cells. Hypervariable regions (HV1 and HV2)in the Dloop of the mtDNA were amplified by PCR, and then were sequenced. Results Nineteen mutations in the Dloop region were found in 6(14.29%) MDS cases. Five microsatellites were unstable, and the others were point mutations. Conclusion Mutations in the Dloop region of mitochondrial DNA were found in MDS patients and they might play an important role in the pathogenesis of myelodysplastic syndromes.

　　Key words： Myelodysplastic syndromes; DNA, mitochondrial; Mutation; Polymorphism

　　通過直接測序法對基因序列進行檢測，從而探討mtDNA突變在MDS發(fā)生發(fā)展中的作用。

　　1 材料與方法

　　1.1 研究對象 初診的MDS患者42例，其中男17例，女25例，25～62歲(中位年齡51歲)。樣本來自2006年10月至2007年4月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院門診和住院MDS患者的骨髓和口腔上皮細胞。其中難治性貧血(refractory anemia，RA)患者21例，環(huán)形鐵粒幼紅細胞性難治性貧血(refractory anemia with ring sideroblast，RARS)患者2例，難治性血細胞減少伴多系增生異常(refractory cytopenia with multilineage dysplasia， RCMD)患者7例，難治性貧血伴原始細胞增多1(refractory anemia with excess blasts1，RAEB1)患者2例，難治性貧血伴原始細胞增多2(refractory anemia with excess blasts2，RAEB2)患者10例。

　　1.2 儀器與試劑 PCR儀為德國eppendorf公司產(chǎn)品，TaqDNA聚合酶購自上海博亞生物技術(shù)有限公司，口腔試子基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒購自北京天根公司。純化后的PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。

　　1.3 方法

　　1.3.1 基因組DNA的提取 收取患者骨髓標本2～3?mL，3.8%枸櫞酸鈉抗凝，同時收取患者口腔上皮細胞。酚-氯仿法抽提骨髓基因組DNA，三甲基氯基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)溶解DNA，-80?℃保存?zhèn)溆谩？谇辉囎踊蚪MDNA提取試劑盒提取取口腔上皮基因組DNA。

　　1.3.2 聚合酶鏈反應(yīng)擴增線粒體DNA 引物序列設(shè)計如下：HV1區(qū)上游引物：5′TAACTCCACCATTAGCACC3′，下游引物：5′ATTGATTTCACGGAGGATG3′，擴增片段長度468?bp;HV2區(qū)上游引物：5′CGACATCTGGTTCCTACTTC3′，下游引物：5′GAAATCTGGTTAGGCTGGTG3′，擴增片段長度488?bp。

　　50?μL的PCR反應(yīng)體系中包含1?μL的mtDNA模版，0.1?μmol/L dNTP，1.0?U TaqDNA聚合酶，2.0?mmol/L MgCl2，10×PCR緩沖液5?μL，引物0.2?μmol/L。循環(huán)參數(shù)：95?℃ 5?min，隨后35個循環(huán)為：94?℃ 45?s，56?℃ 45?s,72?℃ 45?s,后72?℃延伸7?min。反應(yīng)結(jié)束后，從50?μL反應(yīng)體系中取5?μL在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙啶(EB)染色，紫外燈下觀察電泳圖像并確認所測片段是否成功擴增。

　　1.4 DNA序列測定 證實PCR產(chǎn)物成功擴增后，將剩余的PCR產(chǎn)物純化后進行測序。將所測線粒體DNA Dloop區(qū)的HV1區(qū)和HV2區(qū)基因序列與劍橋標準序列(revised Cambridge reference sequence，rCRS)進行對比。在骨髓標本中與劍橋序列不一致的位點再與同一患者的口腔上皮正常組織的序列比較，若此位點的變化在口腔上皮組織中未出現(xiàn)，則定義為突變;若在骨髓標本和口腔上皮中均出現(xiàn)，則定義為多態(tài)，在數(shù)據(jù)庫(MITOMAP、mtDB和GenBank)沒有記錄的認為是新的多態(tài)位點。計算多態(tài)性出現(xiàn)頻率，計算公式為：多態(tài)性出現(xiàn)頻率(%)=多態(tài)性個數(shù)/所測堿基總數(shù)×。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 見圖1，圖2。由圖1可見，1～3號標本在470?bp處出現(xiàn)特異條帶，證實成功擴增出HV1片段。由圖2可見，1～4號標本在490?bp處出現(xiàn)特異條帶，證實成功擴增出HV2片段。所有標本均經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實成功擴增出目的片段。

　　2.2 mtDNA測序結(jié)果分析 見表1，圖3，圖4。在42例MDS患者骨髓標本中共發(fā)現(xiàn)多態(tài)性改變199個，其中在HV1區(qū)(360?bp)131個，單個標本中少發(fā)現(xiàn)1個，多發(fā)現(xiàn)7個，多態(tài)性發(fā)生頻率為0.87%;HV2 區(qū)(316?bp)共68個，單個標本少0個，多5個，多態(tài)性發(fā)生頻率為0.51%。未發(fā)現(xiàn)新的多態(tài)位點。由表1可見，有6例患者檢測到突變，突變位點共19個，計算突變率為14.29%。突變類型為堿基置換突變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定，未發(fā)現(xiàn)堿基缺失。其中5個微衛(wèi)星不穩(wěn)定(HV1區(qū)4個，HV2 區(qū)1個)，這中間有4個是polyC片段中C核苷數(shù)目的增加。其余14個突變位點均為A、G或者C、T之間的堿基置換(HV1區(qū)6個，HV2區(qū)8個)。

　　3 討 論

　　線粒體DNA由于缺乏組蛋白的保護，裸露于氧化磷酸化的環(huán)境中，而且在復(fù)制過程中缺乏必要的修復(fù)機制，故易受致癌物、氧自由基等的損傷，使其突變率是核DNA的10倍以上[3]。與核DNA相比，mtDNA的基因具有很大的簡約性和經(jīng)濟性，其中D環(huán)區(qū)(Dloop區(qū))是mtDNA的非編碼區(qū)。Dloop區(qū)占全部mtDNA的6%左右，位置在16?028～577?bp，富含AT堿基。mtDNA重鏈和輕鏈的轉(zhuǎn)錄啟動子以及重鏈的復(fù)制起始位點均位于此區(qū)域內(nèi)，因此，如果突變點位于mtDNA基因編碼區(qū)，將影響各相關(guān)酶復(fù)合體的功能;如果突變點位于tRNA基因區(qū)，則將影響線粒體13個多肽的翻譯。如果突變發(fā)生在DLoop區(qū)，那么情況將嚴重得多，它將引起整個線粒體功能的紊亂，直接影響線粒體的功能。Dloop區(qū)的突變具有積累效應(yīng)，有隨年齡增長而增加的趨勢，其中兩個高變區(qū)(HV1，HV2)由于高度多態(tài)性和易發(fā)生突變，是近年來研究的熱點區(qū)域。在對很多實體惡性腫瘤如胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等的研究中均發(fā)現(xiàn)存在著一定頻率的mtDNA突變，突變率介于4%～90%[47]。而在對血液系統(tǒng)惡性腫瘤的研究中，Grist等[8]發(fā)現(xiàn)急性白血病患者Dloop區(qū)的突變率為36%，慢性白血病患者為58%，與實體惡性腫瘤的平均突變率相一致。國外雖有文獻報道在MDS患者中發(fā)現(xiàn)mtDNA Dloop區(qū)的突變[910]，但意見不一，研究結(jié)果很不一致。由于研究背景和結(jié)論差異較大，Dloop區(qū)在MDS患者中的突變情況仍存在爭論。

　　本實驗利用PCR產(chǎn)物直接測序法檢測42例MDS患者的mtDNA Dloop區(qū)兩個高變區(qū)基因序列，考慮到mtDNA具有高度的多態(tài)性，把骨髓測序結(jié)果與劍橋序列對比后，出現(xiàn)變化的位點再與患者本人的口腔上皮組織正常細胞對比，只在骨髓中出現(xiàn)的序列變化才認為是突變。發(fā)現(xiàn)在6例患者中有突變，共19個突變位點，其中有5個微衛(wèi)星不穩(wěn)定，其余均為C、T，或者A、G之間的堿基置換突變，突變率為14.29%。這6例檢測到突變的患者包括3個RA患者，2個RAEB2患者，1個RCMD患者。在RARS和RAEB1亞型中未發(fā)現(xiàn)突變點，但因為樣本量較小，加之受到病例選擇的局限，尚不能排除這兩種亞型存在突變的可能性。此外，由于Dloop區(qū)不編碼蛋白，在進化過程中選擇壓力相對較小，因而較其他區(qū)域具有更高的多態(tài)性。本研究中，42例MDS患者mtDNA Dloop區(qū)兩個高變區(qū)共發(fā)現(xiàn)了199個多態(tài)性變化，這兩個區(qū)域的多態(tài)性出現(xiàn)頻率分別為0.87%和0.51%，而人類基因組平均多態(tài)性頻率約為0.1%，可見MDS患者這兩個區(qū)域具有高度的多態(tài)性。但在本研究中未發(fā)現(xiàn)尚未記載的新的多態(tài)位點。

　　目前，MDS的發(fā)病機制尚不清楚，許多環(huán)境因素(苯、電離輻射、超氧毒性等)可能涉及到MDS的發(fā)病，而線粒體DNA尤易受到這些因素的損傷。線粒體DNA突變在MDS發(fā)病中的作用可能與細胞凋亡有關(guān)。已有證據(jù)表明，在MDS中骨髓造血細胞凋亡過度是引起無效造血的主要原因。誘導(dǎo)凋亡的信號多數(shù)引起線粒體功能的改變，使線粒體內(nèi)膜通透性增加，膜電位破壞，促使細胞色素C的釋放，從而觸發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，引起凋亡。由于mtDNA重鏈和輕鏈的轉(zhuǎn)錄啟動子以及重鏈的復(fù)制起始位點均位于Dloop區(qū)，因此Dloop區(qū)的突變將會影響到mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，直接影響線粒體編碼區(qū)的功能，引起整個線粒體功能的紊亂，使線粒體對氧化損傷等多種損傷因素更為敏感或者直接造成細胞凋亡的改變。因此，mtDNA Dloop區(qū)突變引起的線粒體功能缺陷可能是MDS中細胞凋亡過度的內(nèi)在原因。此外，研究發(fā)現(xiàn)線粒體DNA Dloop區(qū)突變與編碼區(qū)的突變有關(guān)[1112]，而某些編碼區(qū)的突變能引起蛋白質(zhì)合成改變。因此，可以推測mtDNA Dloop區(qū)突變可能導(dǎo)致線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體的編碼基因異常，造成高水平活性氧的釋放，而活性氧又可導(dǎo)致新的突變發(fā)生，從而形成惡性循環(huán),并終引發(fā)惡性變。

　　線粒體DNA的突變隨著年齡的增長具有累積效應(yīng)，而個體發(fā)生惡性腫瘤的可能性隨著年齡的增長而提高，這提示線粒體DNA突變的累積與惡性腫瘤發(fā)生的可能性是一致的。本研究中16、19和34號患者分別存在多達4個突變位點，推測可能是線粒體DNA損傷的累積效應(yīng)所致。

　　此外，研究中尚發(fā)現(xiàn)5個微衛(wèi)星不穩(wěn)定的情況，其中有4個是polyC片段中C核苷數(shù)目的增加(見表1)。Maeck等[13]報道在26例MDS患者中發(fā)現(xiàn)2例這樣的改變，認為這種改變與患者線粒體基因組不穩(wěn)定有關(guān)。與核基因相同，線粒體基因組也存在不穩(wěn)定，由于活性氧的破壞、滑鏈錯配和不平衡交換等原因造成線粒體基因組的不穩(wěn)定，其形式以Dloop區(qū)的(CA)n和poly C不穩(wěn)定為常見。多項研究表明，某些癌前病變或腫瘤細胞中均發(fā)現(xiàn)線粒體DNA微衛(wèi)星不穩(wěn)定，腫瘤細胞與正常細胞間存在明顯差異。當mtDNA在多種損傷因素下突變頻率增加，mtDNA微衛(wèi)星不穩(wěn)定性也隨之增加，進而使線粒體發(fā)生功能異常，引發(fā)腫瘤或其他疾病。

　　關(guān)于mtDNA突變在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的具體作用，目前尚無定論，但已證實各種致癌物質(zhì)能夠作用于mtDNA并引起其發(fā)生與腫瘤相關(guān)的遺傳結(jié)構(gòu)的改變。因此，mtDNA突變在腫瘤細胞中的生物學(xué)意義應(yīng)該得到重視。MDS為血液系統(tǒng)的惡性疾病，mtDNA在疾病發(fā)生發(fā)展中的變化值得探討。本研究發(fā)現(xiàn)MDS患者在Dloop區(qū)兩個高變區(qū)存在突變，線粒體DNA Dloop區(qū)在多種損傷因子或致癌物質(zhì)的作用下發(fā)生突變，突變累積增加了腫瘤發(fā)生的危險性。我們推測mtDNA異?？赡苁荕DS患者突變負荷增加的一個反映，而且與患者核基因組不穩(wěn)定性、細胞遺傳學(xué)異常和向白血病轉(zhuǎn)化的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。mtDNA突變可能在MDS的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。如果mtDNA突變與MDS疾病的發(fā)生及生物學(xué)特性的關(guān)系能得到證實，將為其病因?qū)W研究開拓一個新的領(lǐng)域。