光譜核型分析技術(shù)在白血病中的應(yīng)用

作者：郭搏,達萬明,韓曉萍　　作者單位：中國人民解放軍總醫(yī)院血液科，北京 100853

　　【摘要】光譜核型分析技術(shù)是近幾年建立的一種細胞遺傳學(xué)檢測方法，它可以在沒有任何預(yù)知的情況下同時對人的24條染色體進行核型分析，可以識別常規(guī)顯帶和單純應(yīng)用熒光原位雜交難以精確辨認的一些畸變，具有高度的精確性、敏感性、直觀性。本文綜述了光譜核型技術(shù)的原理及其在白血病中的應(yīng)用。

　　【關(guān)鍵詞】 光譜核型分析

　　Abstract Spectral karyotyping (SKY) is a novel cytogenetic technique，has been developed to unambiguously display and identify all 24 human chromosomes at one time without a priori knowledge of any abnormalities involved. SKY discerns the aberrations that can not be detected very well by conventional banding technique and fluorescent in situ hybridization (FISH). So SKY is hyper-accurate，hypersensitive，and hyper-intuitional. In this paper the basic principle of SKY technique and its application in leukemia cytogenetics were reviewed.

　　Key words spectral karyotyping; chromosome; karyotype; leukemia

　　自引入染色體顯帶技術(shù)以來，在白血病及其它惡性血液病中發(fā)現(xiàn)了大量的重復(fù)性畸變，從而使染色體核型檢測不僅成為白血病確診和分型的重要依據(jù)，而且作為獨立的預(yù)后因素之一，對誘導(dǎo)緩解和復(fù)發(fā)的判斷提供了有價值的參考。1997年，WHO已明確將一些染色體異常列為急性白血病的特殊亞型。隨著細胞遺傳學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人類對染色體核型的檢測水平日益提高。在熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)基礎(chǔ)上，光譜核型分析技術(shù)(spectral karyotyping，SKY)、多色FISH(M-FISH)、彩色顯帶FISH(Rx-FISH)等技術(shù)將染色體分析帶入彩色世界。1996年，Schrock等[1]報道了SKY技術(shù)。這一技術(shù)克服了傳統(tǒng)FISH只能檢測已知位點的異常的缺點，可以在沒有任何預(yù)知的情況下將人類及小鼠的全部染色體以不同顏色顯示出來，因而它可用于染色體的全面篩查，將白血病的細胞遺傳學(xué)研究引向深入。

　　SKY技術(shù)的基本原理

　　SKY技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用了光譜干涉儀、頻譜遙感連接電荷耦合器件(charge-coupled-device，CCD)和傅立葉變換(fourier transformation)，在可見光和近紅外范圍去測量所有點的散射光譜，使得多光譜重疊探針得以應(yīng)用，其成像及分析過程分為三部分。

　　雜交反應(yīng)

　　SKY技術(shù)是將人類的24條染色體的涂染探針用5種不同的熒光素或其組合進行不同標記，然后將探針與中期分裂相進行原位雜交，其中SKY應(yīng)用的涂染探針是流式細胞分選技術(shù)分揀出染色體，再經(jīng)退化低聚寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)擴增獲得的。

　　圖像獲取

　　雜交后的標本通過熒光顯微鏡獲得熒光圖像并進行光譜成像，其具體過程為由特制光源和濾鏡激發(fā)所有熒光染料，通過光譜干涉儀，給特定的光譜分配紅、綠、藍3種顯示色，又由CCD獲取每一個像素的干涉圖像，形成一個三維數(shù)據(jù)庫，并得到每個像素的光程差與強度間的對應(yīng)曲線。由于各條染色體所帶有的單個熒光染料不同或組合不同，此曲線經(jīng)傅立葉變換，再由計算機轉(zhuǎn)換后會獲得不同的區(qū)分色，這樣再分配到每條染色體上，使得24條染色體可以不同顏色區(qū)分。

　　圖像分析

　　經(jīng)專門的SKY軟件分析獲得圖像。

　　SKY與M-FISH的比較

　　1996年，Spicher等[2]報道了另一種以不同顏色描繪人類全部染色體的技術(shù)，成為M-FISH。盡管SKY和M-FISH都是在FISH的技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展的，但這兩種技術(shù)在原理上是截然不同的。SKY技術(shù)是建立在離散光譜測量(在每個像素上以不同波長進行測量強度、頻率)的基礎(chǔ)之上的，其優(yōu)點是可以立即并全面鑒定出染色體內(nèi)的異常，如復(fù)雜的重組，易位等，并以不同顏色顯示變化后的派生染色體。檢測染色體內(nèi)部重組時，SKY的精確性為500-1 500 kb[3]，當然這也取決于雜交的優(yōu)劣及分裂相的伸展情況[1，4，5]。

　　SKY測量的是光譜，因而可以增強多色熒光團的識別力，用光譜核型全面分析獲得信息。M-FISH的基本原理是濾鏡成像，它是利用5種專門的熒光濾鏡，通過CCD相機獲得連續(xù)的圖像，并連續(xù)的覆蓋這些圖像。濾鏡對于小數(shù)目獨立光譜的熒光時，分辨力較為可靠，但對于光譜重疊的染色體進行精確分析時，多濾鏡的信號比較低，所以辨認的精確度也要降低。另外，其測量的是光強，易受干擾，特別在染色體的末端辨別力較差，而末端正是白血病染色體檢測的重要部位[6]。因而在染色體檢測上，總體講，SKY要優(yōu)于M-FISH。但SKY也不是完美無缺的技術(shù)，它的缺點是難以鑒定染色體內(nèi)部改變，如一些小的缺失，重復(fù)及染色體內(nèi)的倒位，不能將一些小的染色體片段的來源以可識別的顏色表示出來[7，8]，因此SKY技術(shù)也有待于進一步發(fā)展，并與其它細胞遺傳學(xué)技術(shù)如傳統(tǒng)顯帶，F(xiàn)ISH、比較基因組雜交(CGH)等技術(shù)互補，以獲得全面的核型[8-12]。

　　SKY在血液系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用

　　SKY技術(shù)問世以來，受到廣泛的關(guān)注和研究。Veldman等[7]應(yīng)用SKY研究惡性血液病，其中包括7例急性髓系白血病(AML)及骨髓增生異常綜合癥(MDS)患者。SKY分析證明了常規(guī)顯帶的結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)了未被或未完全被顯帶鑒定出來的核型。由此證明，SKY可用于細胞遺傳學(xué)分析，并具有較高的可靠性和敏感性。此后，SKY被應(yīng)用于更大的樣本中，研究水平不斷提高，迄今已有600多例血液系統(tǒng)腫瘤應(yīng)用SKY進行了核型分析。SKY逐漸成為常規(guī)顯帶技術(shù)的有力補充，其優(yōu)勢主要在以下幾個方面。

　　SKY分析白血病細胞系

　　Mrozek等[13]應(yīng)用SKY和FISH研究了紅白血病細胞系KG-1和KG-1a的細胞遺傳學(xué)，結(jié)果表明這兩系細胞具有幾個相同的核型異常，包括der(4)t(4;8)，del(7q)，der(8)t(8;12)，idic(8)(p11)，der(17)t(15;17)及der(20)t(12;20)，但這兩系也有不同的染色體重排。相對于KG-1，KG-1a丟失了1或2個idic(8)(p11)拷貝，而在KG-1中，具有KG-1a不具備的der(8;22)(q24;q13)、i(11)(q10)和der(19)t(14;19)(q13;q13.4)。研究還發(fā)現(xiàn)有一部分KG-1細胞具有8號染色體長臂的六倍體，這與AML1-ETO基因具有相關(guān)性，為繼續(xù)闡明這兩系細胞的基因?qū)W區(qū)別，提供了線索。

　　CML是一種骨髓的克隆性疾病，具有由慢性期向急變期轉(zhuǎn)變的傾向。NALM-1細胞系是從具有急變傾向的CML患者外周血中分離出來的，Pelz等[14]應(yīng)用SKY及G顯帶及涂染FISH研究了NALM-1的細胞遺傳學(xué)特征，報道CML核型為44，X，-X，der(7)t(7;9;15)(q10;?;q15)，der(9)t(9;9)(p24;q33-q34)t(9;22)(q34;q11)，der(15)t(7;9;15)(?;?;q15)，der(22)t(9;22)(q34;q11)。

　　在一項NK細胞系與NK細胞白血病患者的骨髓白血病細胞的染色體核型對比研究中，Chen等[15]將新的NK細胞系IMC-1培養(yǎng)55周后，將其與NK細胞白血病患者的骨髓白血病細胞，均應(yīng)用SKY進行的染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)兩者均具有結(jié)構(gòu)和數(shù)量的異常。所有在骨髓中具有的結(jié)構(gòu)異常在IMC-1細胞系中均被發(fā)現(xiàn)，并且在細胞系中還有5個骨髓中沒有的染色體重排，兩者還均存在數(shù)量異常，骨髓細胞中存在+7，+8，而在IMC-1中存在有-9，-12，為研究NK細胞的白血病轉(zhuǎn)化提供了依據(jù)。

　　SKY分析隱匿的染色體異常

　　Ohsaka等[16]報道了1例不典型的慢性粒細胞白血病(CML)，其G顯帶具有1個異?？寺?，46，X，-Y，+der(?)t(?;1)(?;q21)及Ph染色體，但RT-PCR示bcr-abl基因陰性，經(jīng)SKY及FISH分析核型為46，X，der(Y)t(Y;1)(q11.1 or.2;q12)，說明CML尚有Ph染色體陰性的。SKY聯(lián)合常規(guī)顯帶及FISH對于疑難性核型的鑒定顯示了重要作用。

　　25%-45%的成人初治AML患者及10%-30%的急性淋巴細胞白血病(ALL)患者經(jīng)常規(guī)顯帶為正常核型。大部分傳統(tǒng)顯帶示為正常核型的染色體標本在SKY分析后仍是正常的，但是仍有一部分G或R顯帶正常的核型被SKY鑒定出隱匿的異常[8，11，17-20]。Zhang等[11]應(yīng)用SKY研究了28例常規(guī)顯帶正常核型的患者，發(fā)現(xiàn)有2例患者是常規(guī)顯帶沒有鑒定出來的核型，其中1例為與MLL基因相關(guān)的隱匿的t(11;19)，另1例為7號染色體的單倍體克隆，這都與預(yù)后不良相關(guān)。Higenfeld等[17]的研究中也除了發(fā)現(xiàn)隱匿的t(11;19)外還發(fā)現(xiàn)了同樣預(yù)示著預(yù)后不良的5q-。而在Kakazu等[8]的研究中同樣發(fā)現(xiàn)了t(11;19)，說明這是一個容易被常規(guī)顯帶漏檢的易位。

　　大約有75%-90%的兒童ALL患者具有克隆性染色體異常，而10%-25%的異常不能被常規(guī)G顯帶所發(fā)現(xiàn)。Lu等[20]應(yīng)用SKY分析了29例初發(fā)的兒童前B細胞ALL的核型，鑒定出6例隱匿的t(12;21)(p14;q11)。在兒童ALL中，大部分12p的異常與t(12;21)(p13;q22)相關(guān)，并形成由位于12p13的TEL/ETV6基因與位于21q22的AML/CBFA2的融合基因。這種易位由于帶型相似不容易被常規(guī)G顯帶鑒定出來，這6例患者后由TEL/AML1探針FISH重新檢測，并確認了SKY的結(jié)論。另外SKY還鑒定出2例標記染色體，5例非重復(fù)性易位，并且鑒定出2例G顯帶沒有檢測出來的其它異常。這項研究表明SKY在鑒定復(fù)雜染色體異常方面具有更高的精確性。

　　SKY分析復(fù)雜核型

　　有一部分AL具有復(fù)雜核型，常規(guī)顯帶費時、費力，敏感性較低，尤其是鑒定缺失和一些不平衡易位時，一些相似的條帶難以確定其來源。在這種情況下，SKY具有優(yōu)越性，可以修正或補充常規(guī)顯帶的結(jié)論，獲得更全面，更精確的核型。

　　Tchinda等[5]對35例包括AML、ALL、MDS在內(nèi)的復(fù)雜核型的研究中，以SKY、G顯帶及FISH進行了研究。SKY共檢測出149處異常，其中117處得到精確定位。有33例SKY擴展了G顯帶的結(jié)果，其中有7例患者由SKY發(fā)現(xiàn)了其它的異常，有5處為隱匿性的。另有8處G顯帶示為單倍體的，經(jīng)SKY分析認為是標記染色體或派生染色體，3處缺失經(jīng)SKY證實為易位。還有2例患者，由于G顯帶下具有相似的帶型，顯示部分核型為add(9)(p24)和add(6)(p11)，add(14)t(q32)，而經(jīng)SKY分析證明這是不同的衍生染色體，核型為der(9)t(9;12)(p24;p11.2)及der(6;11)(q10;q10)，der(14)t(1;14)(?;q32)，后經(jīng)FISH證實了SKY的結(jié)論。只有1例，SKY由于雜交不良沒有獲得結(jié)果。

　　隨著血液病的發(fā)展，對染色體核型的精確度要求日益增高，尤其是在一些與預(yù)后密切相關(guān)的核型異常中，SKY分析能更準確的鑒定核型，禰補了常規(guī)顯帶的不足，甚至使患者的治療及預(yù)后得以重新判斷，因而對臨床有重要的價值。

　　在Odero等[12]的報道中，有18例AML及MDS患者進行了SKY分析，有3例證明了G顯帶結(jié)果，其他15例，有一部分SKY補充了G顯帶的結(jié)果，另外還意外發(fā)現(xiàn)了一些隱匿的核型異常。其中有13例G顯帶具有-5或-7，或者具有3q-、5q或7q-的病例，SKY證實了其中6例的結(jié)果，但在其他7例患者中檢測出了新的異常，為易位、環(huán)狀染色體等其它異常。如有3例核型為-5的病例，SKY分析后認為為der(5)t(5;12)(q31;q13)、der(7)t(5;7)(q?13;p15)t(5;13)(q?33;q?22)和der(5)t(5;17)(q13;q2?3)。還有1例核型為del(5)(q15q33)，SKY分析其在5、6號染色體易位過程中丟失了部分5q，實際核型為der(5)t(5;6)(q15;p22)。5號及7號染色體的缺失及5q-，7q-往往預(yù)示者極為不良的預(yù)后，而調(diào)整分析后結(jié)果使這些患者的預(yù)后判定并不是那么差。

　　Mrozek等[21]研究了29例具有復(fù)雜核型的成人AML，經(jīng)SKY分析揭示了全部不平衡易位中未知的染色體及大部分環(huán)狀染色體和標記染色體的來源，重新分析了136種染色體異常，發(fā)現(xiàn)了3種隱匿的異常，SKY證實了10種并闡明了3種平衡易位，并發(fā)現(xiàn)了另外9個平衡易位，其中1個與RUNX1基因相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)8例患者具有+21q，其中有4例具有21q的大量擴增，F(xiàn)ISH顯示其中7例與RUNX1基因擴增無關(guān)，另一個獲得頻率較高的片斷是11q，有7例患者，其中有3例具有MLL基因的擴增，有7例患者具有+22q。SKY提高了核型分析的精確性，并表明染色體的擴增在白血病細胞遺傳學(xué)中有較重要的作用。

　　綜上所述，光譜核型分析技術(shù)已成為非常有效的細胞遺傳學(xué)研究工具，具有較高的精確性，敏感性和直觀性，對于染色體異常的檢測及新的白血病亞型的鑒定有重要意義。隨著SKY的自我完善，及與其它細胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合，SKY的發(fā)展和推廣將為白血病生物學(xué)研究帶來更廣闊的前景。

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