6 種固定液短時間固定對冰凍切片制片效果影響

冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度，然后進行切片的方法。由于其制作過程較石蠟切片快捷、簡便，而多應用于手術(shù)中的快速病理診斷。但在冰凍切片制過程中影響制片的質(zhì)量因素較多，從而影響手術(shù)中的快速病理診斷。因此，快速制作一張高質(zhì)量的冰凍切片對于確保病理診斷極其重要。 其中固定是冰凍切片制作中關(guān)鍵步驟之一，對切片的制片質(zhì)量有著重要的影響。本文通過6種不同固定液短時固定對冰凍切片制片染色的比較，探討不同固定液對冰凍切片制片效果的影響。

1資料與方法

1.1材料
選自病理科手術(shù)切除的新鮮組織標本40例，包括有乳腺、甲狀腺、胃、子宮、卵巢等組織。

1.2固定液 6種固定液分別為：10%福爾馬林；95%酒精；AF固定液；丙酮∶甲醇∶乙醚酒精（乙醚∶酒精1∶1）。

1.3方法
1.3.1
取材及切片取材大小為1.5cm×1.5cm，厚2～3mm的新鮮組織，用OCT包埋劑包埋后，放進切片機（溫度-18℃～20℃），1～2min后，每例標本連續(xù)切片各6張，厚度4～5μm。

1.3.2
固定及染色切片后立即放進上述6種不同的固定液（室溫20～25℃）固定6s。將固定過的切片用蒸餾水洗30s，放進改良的GILL蘇木素液（預先放在65°恒溫水域箱加熱）2min，自來水洗，1%鹽酸酒精分化液分化10s，溫水（50℃）藍化30s，伊紅染色30s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。2結(jié)果切片制作好后，通過對6種不同固定液的對比，在顯微鏡下觀察切片的組織清晰度、細胞收縮度、細胞核染色、細胞漿染色、核漿對比情況。結(jié)果見表1。

表1 6種不同固定液的對比

1. 3. 1 取材及切片取材大小為1. 5 cm × 1. 5 cm，厚2 ~ 3 mm 的新鮮組織，用OCT切片機（ 溫度-18°C ~ 20°C ） ，1 ~ 2 min 后，每例標本連續(xù)切片各6 張 ,厚度 4 ~ 5 μ m 。

1. 3. 2 固定及染色切片后立即放進上述 6種不同的固定液（室溫20 ~ 25°C ）固定 6s。將固定過的切片用蒸餾水洗 30 s，放進改良的GILL 蘇木素液（預先放在65° 恒溫水域箱加熱）2 min，自來水洗,1%鹽酸酒精分化液分化 10 s，溫水（50°C ）藍化30 s，伊紅染色30 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明, 中性樹膠封片。

2 結(jié)果
切片制作好后，通過對6種不同固定液的對比,在顯微鏡下觀察切片的組織清晰度、細胞收縮度、細胞核染色、細胞漿染色 、核漿對比情 況。結(jié)果見表 1 。 從觀察結(jié)果顯示，在 6 種固定液固定的冰凍切片中，經(jīng)乙醚酒精固定后的冰凍切片，鏡下組織細胞形態(tài)清晰，細胞無收縮 ，細胞核 、細胞漿染色鮮艷 ，核漿對比良好。甲醇固定的冰凍切片質(zhì)量次之。95%酒精固定的切片，除細胞明顯收縮外，組織結(jié)構(gòu)較清晰,細胞染色尚可。丙酮和AF液固定的冰凍切片，組織結(jié)構(gòu)較清晰度稍差，細胞漿染色及核漿對比均差, 而且丙酮固定的細胞收縮較為嚴重。10%福爾馬林固定的冰凍切片組織清晰度、細胞核染色、細胞漿染色及核漿比均差，同時細胞腫脹，尤其是細胞核明顯腫脹、模糊。

3 討論
冰凍切片的目的是在短時間內(nèi)作出準確的病理診斷，協(xié)助臨床醫(yī)生確定病變的范圍，決定手術(shù)的范圍，因此，必須盡一切可能爭取時間 ，爭取盡快早出切片 ，并保證質(zhì)量 ，所以快速制作一張高質(zhì)量的冰凍切片非常重要。中華醫(yī)學會規(guī)定完成冰凍HE染色切片制備時間通常為20~25min，在冰凍切片制片中，固定液的選擇及固定的時間長短是冰凍切片 HE染色的一個關(guān)鍵步驟。用于冰凍組織的固定液種類較多，大多數(shù)固定液需要固定幾分鐘至十幾分鐘時間，如果只固定數(shù)秒鐘，則大多數(shù)切片固達不到診斷的要求。由于冰凍切片是由快速切片，快速固定，快速染色這三個方面相互影響所造成的，其中由于組織固定液因素影響組織細胞形態(tài)的改變，對病理醫(yī)生的診斷影響大，遠比其他技術(shù)員操作因素引起的組織細胞形態(tài)改變更難把握。研究表明10%福爾馬林雖然對組織的穿透力強，固定效果好，但需要固定的時間長，而且它不能抵消因冷凍所引起的細胞內(nèi)液體的腫脹，所以甲醛固定的組織，核發(fā)生腫脹、模糊。從上述6種固定液的比較來看，如果只進行數(shù)秒鐘的短時固定，10% 的福爾馬林和AF 液固定的組織，組織清晰度差，細胞核和細胞漿著色較淡 ,核漿對比差。95% 酒精固定效果尚可，但細胞收縮明顯，核漿著色稍差。丙酮固定劑，對組織穿透性強，但細胞嚴重收縮，核漿對比差。甲醇固定的組織，細胞輕度收縮性,組織結(jié)構(gòu)清晰，核著色好。但是乙醚酒精固定液的冰凍切片能較好的保存細胞的正常結(jié)構(gòu)，組織清晰，背景干凈，細胞無收縮，核漿染色鮮艷，核漿對比良好,是 6種固定液中好的。因此，乙醚酒精可以短時間內(nèi)固定細胞，縮短制片時間，是一種較為理想的冰凍切片快速固定液。