PKM1、PBRM1和S100A9基因敲除細(xì)胞為癌癥治療提供

基因敲除細(xì)胞是指利用CRISPR技術(shù)進(jìn)行基因編輯，通過設(shè)計(jì)特定的sgRNA靶向目標(biāo)基因的剪切位點(diǎn)，使Cas9蛋白與sgRNA結(jié)合并將目的基因從細(xì)胞中"剪切"掉，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除?；蚯贸?xì)胞在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥物研發(fā)等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用前景，如利用基因敲除技術(shù)建立疾病模型、進(jìn)行藥物篩選和靶點(diǎn)驗(yàn)證、敲除致病基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)疾病的基因治療等。本文選取三篇基因敲除細(xì)胞的相關(guān)研究為大家進(jìn)行解讀，帶您了解這一前沿技術(shù)的新進(jìn)展。

一、CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功敲除PKM1基因，優(yōu)化CHO細(xì)胞系的乳酸生成行為 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）是生物制藥行業(yè)常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系之一，用于生產(chǎn)各種治療性蛋白質(zhì)，如抗體、激素和其他重組蛋白。丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase Muscle，PKM）是一種負(fù)責(zé)在糖酵解過程中將PEP轉(zhuǎn)變?yōu)楸岬拿?，丙酮酸可用于?xì)胞能量產(chǎn)生或轉(zhuǎn)化成乳酸。在CHO細(xì)胞中，PKM1的表達(dá)水平與乳酸生成行為直接相關(guān)。研究人員通過CRISPR/Cas9的技術(shù)手段敲除PKM1基因可以消除乳酸積累。

研究人員在本研究中采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了PKM1基因，目的是探索PKM1在CHO細(xì)胞系乳酸生成中的功能，并探究PKM1水平與乳酸生成之間的直接關(guān)系。研究結(jié)果顯示，在PKM1基因被敲除的細(xì)胞系中，未觀察到乳酸積累，即使在促進(jìn)乳酸積累的培養(yǎng)條件下，乳酸積累也得到了有效控制，這表明PKM1的活性對(duì)于乳酸的生成至關(guān)重要。此外，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除PKM1基因的細(xì)胞系在生產(chǎn)力和細(xì)胞活力方面與野生型細(xì)胞系相似，說明PKM1的缺失并不會(huì)對(duì)細(xì)胞的生存能力或生產(chǎn)能力產(chǎn)生不利影響。在工業(yè)生產(chǎn)中，高水平的乳酸生成可能會(huì)導(dǎo)致CHO細(xì)胞活力和生產(chǎn)力的下降，影響生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。乳酸積累還可能引起培養(yǎng)基pH值下降，需要添加堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值，這可能會(huì)導(dǎo)致滲透壓增加，進(jìn)一步影響細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)生產(chǎn)。利用CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)敲除或抑制PKM1的表達(dá)，有助于減少或消除乳酸生成，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。

二、PBRM1基因敲除與ccRCC中較低的免疫原性TME相關(guān) 腎細(xì)胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是全球十大常見惡性腫瘤之一，常見的組織學(xué)亞型為透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（clear cell RCC，ccRCC）。ccRCC中存在重要的繼發(fā)性基因突變，包括PBRM1（polybromo-1）基因。PBRM1是開關(guān)/蔗糖非發(fā)酵(SWI/SNF)染色質(zhì)重塑復(fù)合體的一部分，約40%的ccRCC存在PBRM1突變。到目前為止，關(guān)于PBRM1缺失對(duì)免疫反應(yīng)的影響的數(shù)據(jù)是不一致的，因此研究人員對(duì)于ccRCC中PBRM1缺失對(duì)腫瘤微環(huán)境（TME）的影響進(jìn)行了研究。 通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，研究人員敲除了Pbrm1基因，并建立了Pbrm1敲除的Renca小鼠RCC細(xì)胞系及其腫瘤模型，同時(shí)使用了Renca-Balb/c免疫小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。他們利用免疫組織化學(xué)（IHC）染色技術(shù)對(duì)小鼠腫瘤中的免疫標(biāo)記物進(jìn)行了評(píng)估，包括CD3、CD8、CD4、PD-1和P-STAT1。結(jié)果顯示，與Pbrm1基因敲除小鼠相比，對(duì)照組小鼠腫瘤中CD3、CD4、CD8 T細(xì)胞和p-STAT1陽(yáng)性細(xì)胞的水平更高，而且免疫檢查點(diǎn)蛋白PD-1在對(duì)照腫瘤中的表達(dá)也更強(qiáng)烈。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除了Pbrm1基因的細(xì)胞系構(gòu)建腫瘤模型證明Pbrm1缺陷與較低的免疫原性腫瘤微環(huán)境有關(guān)，對(duì)腫瘤的免疫治療具有重要意義。

三、S100A9的敲除為SICM的致病機(jī)制的研究提供更進(jìn)一步探索 敗血癥性心肌病（Sepsis-induced cardiomyopathy，SICM）是一種常見的由敗血癥引起的心功能障礙，SICM的病理機(jī)制非常復(fù)雜，包括幾個(gè)關(guān)鍵因素，如心肌抑制、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。S100鈣結(jié)合蛋白A9（S100A9）是一種鈣和鋅結(jié)合蛋白，在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，但目前對(duì)S100A9誘導(dǎo)敗血性心力衰竭和心肌損傷的確切機(jī)制了解有限。

研究人員通過CRISPR-Cas9技術(shù)敲除了小鼠S100a9基因，并讓原代心肌細(xì)胞接觸脂多糖，以此模擬SICM。他們通過測(cè)量炎癥標(biāo)志物和S100A8/9的表達(dá)來(lái)成功模擬敗血癥誘導(dǎo)的心肌病。胸部超聲心動(dòng)圖的結(jié)果顯示，與野生型小鼠相比，S100a9基因敲除小鼠在敗血癥誘導(dǎo)的心肌病中心肌損傷有所減輕，且心肌功能得到恢復(fù)。使用透射電子顯微鏡對(duì)線粒體嵴密度的測(cè)量發(fā)現(xiàn)，在野生型對(duì)照組中心肌細(xì)胞的線粒體形態(tài)均勻，而在野生型敗血癥組中，線粒體的數(shù)量和大小異質(zhì)性增加。敲除S100a9基因后，線粒體的損傷有所減輕，并恢復(fù)了正常的結(jié)構(gòu)。這些研究結(jié)果表明S100A9與敗血癥誘導(dǎo)的心臟損傷和功能障礙有關(guān)，并揭示了S100A9誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙的潛在機(jī)制。利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除S100A9基因的細(xì)胞來(lái)研究該基因與SCIM間的關(guān)聯(lián)性，提供一種SCIM可能的治療方案，對(duì)SCIM致病機(jī)理的研究做出貢獻(xiàn)。