CRISPR篩選揭示癌癥中合成致死作用，為靶向治療提供新靶點(diǎn)

DNA損傷反應(yīng)（DDR）是細(xì)胞為了應(yīng)對(duì)各種DNA損傷（如輻射、化學(xué)藥物、復(fù)制壓力等）而啟動(dòng)的復(fù)雜信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。這個(gè)過(guò)程對(duì)于維持基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞生存至關(guān)重要。許多與癌癥相關(guān)的基因變異都與DDR機(jī)制的失調(diào)密切相關(guān)，因此這些機(jī)理研究是癌癥研究和治療的一個(gè)重要領(lǐng)域。

研究人員通過(guò)DNA 損傷反應(yīng)中功能性賴氨酸殘基和基因的全基因組篩選構(gòu)建了一個(gè)包含多個(gè)潛在DDR基因突變的文庫(kù)，并利用堿基編輯技術(shù)精確地對(duì)這些基因進(jìn)行編輯，產(chǎn)生不同的突變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， C17orf53 的 K494 突變會(huì)破壞其與 RPA 蛋白的相互作用，從而導(dǎo)致對(duì)順鉑的敏感性增加。此外，研究人員分析確定了STK35是一種以前未被發(fā)現(xiàn)的參與 DNA 損傷反應(yīng) (DDR) 通路的基因，這表明它可能在 DNA 修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。該研究系統(tǒng)地解析了DDR機(jī)制，揭示了新的潛在治療靶點(diǎn)，為癌癥研究和基因治療提供了寶貴的線索。過(guò)這一四重 sgRNA 文庫(kù)，研究人員在敲除和沉默實(shí)驗(yàn)中獲得了高擾動(dòng)效率，在激活實(shí)驗(yàn)中也取得了的倍數(shù)變化。此外，在對(duì) 1,634 種人類轉(zhuǎn)錄因子的陣列激活篩選中，發(fā)現(xiàn)了 11 種新的 PrPC 調(diào)節(jié)因子，并通過(guò)消融文庫(kù)的匯集版本篩選，鑒定出 5 種新的自噬修飾因子，這些因子在傳統(tǒng)篩選中未被發(fā)現(xiàn)。綜上所述，四重 sgRNA 陣列文庫(kù)為全基因組擾動(dòng)研究提供了一個(gè)強(qiáng)大且多功能的資源，能夠揭示新的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制并推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

2、文章題目：A multilineage screen identifies actionable synthetic lethal interactions in human cancers

期刊：Nature Genetics（IF：31.7）

癌癥中常見(jiàn)的基因突變會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性或信號(hào)傳導(dǎo)異常，這為合成致死相互作用提供了獨(dú)特的靶點(diǎn)。然而，不同癌癥類型間的異質(zhì)性和復(fù)雜性使得找到普遍有效的合成致死靶點(diǎn)極具挑戰(zhàn)。研究人員描述了一種名為SCHEMATIC的識(shí)別高度滲透、可操作的遺傳相互作用核心網(wǎng)絡(luò)的策略。

為了檢測(cè)哪些基因的喪失與已存在的癌癥驅(qū)動(dòng)基因突變（如TP53、KRAS）具有合成致死關(guān)系，研究者使用基因組規(guī)模的CRISPR敲除文庫(kù)，在一組代表不同組織來(lái)源和癌癥類型的人類癌癥細(xì)胞系中進(jìn)行高通量篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個(gè)與癌癥驅(qū)動(dòng)基因（如TP53、KRAS突變）存在合成致死相互作用的靶點(diǎn)，包括普遍適用的泛癌靶點(diǎn)（如USP28與TP53缺失的合成致死關(guān)系）以及特定癌癥類型相關(guān)的靶點(diǎn)（如KRAS突變與特定細(xì)胞周期調(diào)控基因的依賴性）。功能驗(yàn)證顯示，這些靶點(diǎn)的敲除或抑制能夠抑制癌細(xì)胞的增殖，而對(duì)正常細(xì)胞影響較小。該研究發(fā)現(xiàn)的靶點(diǎn)具有藥物可操作性，為癌癥精治療和廣譜抗癌藥物開(kāi)發(fā)提供了明確方向。

（二）CRISPR檢測(cè)

1、文章題目：Synthetic mismatches enable specific CRISPR-Cas12a-ba[x]sed detection of genome-wide SNVs tracked by ARTEMIS

期刊：Cell Reports Methods（IF：4.3）

單核苷酸變異（Single Nucleotide Variants, SNVs）在個(gè)性化醫(yī)學(xué)和基因組學(xué)研究中具有重要意義。傳統(tǒng)的SNV檢測(cè)方法（如高通量測(cè)序和PCR）雖廣泛應(yīng)用，但存在成本高、靈敏度受限或難以區(qū)分單個(gè)堿基變化的問(wèn)題。研究人員提出了一種基于CRISPR/Cas12a的檢測(cè)策略，結(jié)合合成錯(cuò)配（synthetic mismatches）和新開(kāi)發(fā)的ARTEMIS（Allele-specific Reporter Tailored for Enhanced Mismatch Identification and Sensing）平臺(tái)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)全基因組范圍內(nèi)SNVs的特異性檢測(cè)。

研究人員引入合成錯(cuò)配的crRNA提升了Cas12a對(duì)單個(gè)核苷酸差異的辨別能力，能夠準(zhǔn)確區(qū)分靶序列與具有高度相似性的非靶序列；Cas12a系統(tǒng)能夠檢測(cè)低至亞納摩爾濃度的DNA序列，并適用于不同背景的基因組DNA；在多個(gè)模型基因和患者樣本中，研究人員成功驗(yàn)證了該平臺(tái)對(duì)關(guān)鍵致病SNVs的檢測(cè)能力。傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)相比，CRISPR/Cas12a方法具備更高的時(shí)間效率和成本效益。這些結(jié)果為高保真 CRISPRdx 的合理化 crRNA 設(shè)計(jì)提供了見(jiàn)解，支持腫瘤診斷中個(gè)性化且經(jīng)濟(jì)高效的醫(yī)療解決方案。

2、文章題目：A novel single-tube LAMP-CRISPR/Cas12b method for rapid and visual detection of zoonotic Toxoplasma gondii in the environment

期刊：Pnfectious Diseases of Poverty（IF：4.8）

弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）是一種重要的人畜共患病原體，在人類和動(dòng)物中均可引發(fā)嚴(yán)重的健康問(wèn)題?？焖佟㈧`敏地檢測(cè)環(huán)境中該病原體的存在對(duì)公共衛(wèi)生和環(huán)境監(jiān)測(cè)具有重要意義。然而，現(xiàn)有方法如PCR雖靈敏但耗時(shí)且需要復(fù)雜的設(shè)備，難以適用于資源有限的地區(qū)。研究人員開(kāi)發(fā)了一種基于單管LAMP-CRISPR/Cas12b的新型檢測(cè)方法，能夠快速、靈敏且直觀地檢測(cè)環(huán)境中的T. gondii。

該方法以弓形蟲(chóng) B1基因?yàn)槟繕?biāo)，首先用 LAMP 對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，由單向?qū)?RNA（sgRNA）引導(dǎo)。然后，它識(shí)別擴(kuò)增的目標(biāo)基因并激活反式切割，切割附近的單鏈 DNA（sgRNA）報(bào)告基因。使用 6-羧基熒光素（FAM）-12N-黑洞猝滅劑-1（BHQ1）報(bào)告基因進(jìn)行熒光檢測(cè)，而異硫氰酸熒光素（FITC）-12N-生物素可在橫向流動(dòng)試紙上進(jìn)行直觀檢測(cè)。

LAMP-CRISPR/Cas12b 方法表現(xiàn)出高特異性和廣譜檢測(cè)能力，成功識(shí)別了 9 種弓形蟲(chóng)基因型，并將其與 11 種其他寄生蟲(chóng)區(qū)分開(kāi)來(lái)。分子（質(zhì)粒）和實(shí)際（卵囊）水平的靈敏度測(cè)試顯示檢測(cè)限分別為 10 拷貝/μL 和 0.1 個(gè)卵囊。當(dāng)應(yīng)用于 112 個(gè)環(huán)境樣本（土壤、水和貓糞）時(shí)，該方法表現(xiàn)出的靈敏度，準(zhǔn)確反映已知的感染率。這種 LAMP-CRISPR/Cas12b 單管方法為監(jiān)測(cè)環(huán)境樣本中的人畜共患弓形蟲(chóng)病提供了一種強(qiáng)有力的創(chuàng)新方法，對(duì)公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)具有重要意義。

（三）其他CRISPR相關(guān)研究

1、文章題目：High-accuracy crRNA array assembly strategy for multiplex CRISPR

期刊：Molecular Therapy: Nucleic Acid（IF：6.5）

CRISPR/Cas9技術(shù)是一種強(qiáng)大的基因編輯工具，能夠高效、精地對(duì)基因組進(jìn)行靶向修改。在多重基因編輯（multiplex CRISPR）中，多個(gè)靶位點(diǎn)的同時(shí)編輯是提高研究效率和應(yīng)用廣度的重要手段。然而，現(xiàn)有的多重CRISPR系統(tǒng)常面臨幾個(gè)問(wèn)題，如crRNA設(shè)計(jì)復(fù)雜、合成成本高和引導(dǎo)序列不準(zhǔn)確等問(wèn)題，這些因素限制了其在基因組編輯中的廣泛應(yīng)用。

因此，研究人員提出了一種新穎、高度準(zhǔn)確、成本低且省時(shí)的 CRISPR 陣列組裝策略。使用這種策略，研究人員在一次反應(yīng)中高效地組裝了 12 個(gè) CRISPR RNAs （crRNAs）（用于 AsCas12a）和 15 個(gè) crRNA（用于 RfxCas13d）。由 Pol II 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 CRISPR 陣列表現(xiàn)出與由 Pol III 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 CRISPR 陣列不同的表達(dá)模式，這可用于實(shí)現(xiàn) CRISPR 強(qiáng)度的特定分布。隨后研究人員設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了用于表達(dá)長(zhǎng) CRISPR 陣列的改進(jìn)方法。該研究提供了一種靈活而強(qiáng)大的工具，可方便地在 DNA 和 RNA 上實(shí)施多重 CRISPR，從而有助于解剖復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)并實(shí)現(xiàn)未來(lái)的多靶基因治療。這一創(chuàng)新為多重基因編輯技術(shù)的應(yīng)用提供了新的工具，具有廣泛的生物學(xué)研究和臨床治療潛力。

2、文章題目：Construction of a recombinant African swine fever virus with firefly luciferase and eGFP reporter genes and its application in high-throughput antiviral drug screening

期刊：Antiviral Research（IF：4.5）

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的豬的一種高致死性接觸性傳染病，主要感染家豬和野豬，死亡率高。目前，尚無(wú)針對(duì)ASFV安全有效的商用疫苗或藥物。研究人員將ASFV 0428C毒株在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代，改良株ASFV在Vero細(xì)胞中表現(xiàn)出高效復(fù)制。以改良株ASFV為親本病毒，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建重組ASFV變異株（rASFV-FLuc-eGFP）。 rASFV-Fluc-eGFP基因穩(wěn)定，能有效感染豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）和Vero細(xì)胞，且同時(shí)表達(dá)Fluc和eGFP。本研究為研究ASFV的感染和致病機(jī)制、篩選必需宿主基因和抗病毒藥物提供了工具。

此外，建立了基于rASFV-FLuc-eGFP的傳代細(xì)胞高通量抗病毒藥物篩選模型，從FDA批準(zhǔn)的化合物庫(kù)中篩選出218個(gè)化合物，鑒定出5個(gè)在Vero細(xì)胞中有明顯抑菌效果的候選化合物。進(jìn)一步在Vero和PAM細(xì)胞中驗(yàn)證了其對(duì)ASFV的抑制作用，鑒定出丹酚酸C（SAC），其在兩種細(xì)胞類型中均表現(xiàn)出抑制作用且安全性良好。SAC是防治ASFV的候選藥物，具有良好的應(yīng)用前景。本研究通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、感染、報(bào)告基因監(jiān)測(cè)和高通量藥物篩選相結(jié)合，成功建立了一種高效、靈敏的抗非洲豬瘟病毒藥物篩選平臺(tái)。此外，這種基于報(bào)告基因的篩選平臺(tái)可擴(kuò)展應(yīng)用于其他病毒的研究和藥物篩選，具有廣泛的潛在應(yīng)用價(jià)值。