一文讀懂冷凍電鏡（Cryo-EM）及其在結構生物學中的應用

結構是功能的基礎，對結構進行解析有助于探究其作用機制。近年來，冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）在研究生物大分子結構方面取得了突飛猛進的發(fā)展，在生物學領域的應用越來越受到重視，逐漸成為一種被普遍接受的研究生物大分子的有效研究手段，成為連接生物大分子和細胞的紐帶和橋梁，為基于結構的藥物發(fā)現領域帶來了新的突破。

冷凍電子顯微鏡的結構

冷凍電子顯微鏡的儀器結構與透射電子顯微鏡的基本結構相似，只是在進樣之前搭載了液態(tài)乙烷罐與冷凍倉，保證在樣品快速冷凍后能夠即刻轉移至樣品倉內。

冷凍電鏡發(fā)展過程

冷凍電子顯微鏡技術（cryo-electron microscopy）是在20世紀70年代提出的，早在20世紀70年代科學家們就利用冷凍電鏡研究病毒分子的結構，提出了冷凍電鏡技術的原理、方法以及流程的概念。

到了20世紀90年代，隨著冷凍傳輸裝置、場發(fā)射電子槍以及CDD成像裝置的出現，冷凍電鏡單顆粒技術出現。

21世紀初，冷凍電鏡技術進一步發(fā)展，利用三維重構技術獲得了二十面體病毒的三維結構，但此時冷凍電鏡的分辨率水平依然沒有得到突破，這限制了冷凍電鏡在生物大分子領域的應用。

然而2013年12月5日，美國加州大學舊金山分校副教授程亦凡與同事David Julius兩個實驗室合作，采用單電子計數探測器，以近原子分辨率（3.4?），確定了在疼痛和熱知覺中起中心作用的一種膜蛋白TRPV1的結構，這一振奮人心的成果讓研究人員們開始重新審視冷凍電鏡在結構生物學研究中的所能發(fā)揮的作用。畢竟和X射線晶體學方法相比，它所需的樣品量很少，也無需生成晶體，這為一些難結晶的蛋白質的研究帶來了新的希望。蛋白質TRPV1結構的確定標志著冷凍電鏡正式跨入"原子分辨率"時代。

實驗流程

1. 蛋白樣本

包括蛋白的表達、純化過程。

2. 負染檢測及評估

一種簡單快速的評價樣本質量的方法。將重金屬染色劑應用于樣本，增強對比度，可以快速可視化地進行樣本質量初步評估。這一步驟中主要評估樣 本的均勻性（蛋白/復合物狀態(tài)）、分散性、蛋白質/復合物的大小和形狀、蛋白質濃度（觀察顆粒分布情況）。

3.冷凍制樣及評估

在制備冷凍樣品之前應確保樣品經過完備的生化提純過程，以具備較低的結構異質性；同時還要保證蛋白分子活性。冷凍制樣通常將微量樣本 （3-5μl）交由Vitrobot進行處理，制備出一層極薄的分子溶液層，并由液乙烷快速冷凍。冷凍后，樣品中的水分子不會形成結晶冰 ，而會形成無定 形（玻璃狀）冰層。此時樣本分子將較好地分布在冰層中。在開始采集數據前，仍需對冷凍樣品進行診斷評估，包括蛋白濃度、分布、穩(wěn)定性，冰層的質量、厚度、均勻度和載網的均一性。

4. 數據采集、處理

高度穩(wěn)定的200kV及300kV冷凍電鏡提供高通量、自動化的數據收集。這一過程中透射電鏡將采集數萬張至數百萬張高分辨率單顆粒圖片，并由特定 的算法程序進行數據整理。

5. 三維重構、模型建立

大分子的三維重構依賴于對數以萬計的顆粒圖片進行平均，這個過程中數據需要經過多步處理，需要調用適當的計算資源。在分析結構前，需要進行 完好的數據基礎存儲架構，用來支持可生成TB級數據的冷凍電鏡設施。三維重構的核心是軟件算法，可用于測定及整合每一張照片的諸多參數如空間 取向，而后才能將二維的圖片整合重構為三維的模型。

優(yōu)勢與不足

優(yōu)勢：

·             快速冷凍制樣處理，可使樣本保持近自然水合狀態(tài)

·             允許檢測同一靶蛋白的多種構象

·             無需結晶，可解析業(yè)界難點膜蛋白

·             可解析大型蛋白復合物的結構

·             微克級樣品需求，對蛋白純度耐受性高

不足：

（1）樣品制備的困難。樣品制備的關鍵要求是顆粒朝向必須是隨機分布的，但樣品制備過程操作會對顆粒的隨機分布造成影響。

（2）要求樣品結構均一性。多個顆粒的圖像數據必須進行合并和平均以形成3D重構圖，若要實現高分辨率，就必須保持樣品結構的均一。

（3）蛋白顆粒構象多樣。理論上說，單顆粒冷凍電鏡的一大優(yōu)勢就在于能區(qū)別不同的功能構象，但是有時候不同的構象相似度太高，導致區(qū)別起來非常棘手。

（4）成像理論需要進一步研究。冷凍電鏡現有的成像理論是一種數學上的近似法。如果要進一步提高結構解析的分辨率，就需要用到更為復雜的電鏡成像理論來提取圖像。近年來，在單顆粒分析中取得重大突破的是大似然估計理論，它在圖像匹配、2D和3D分類與模型優(yōu)化上均有應用，是一個強有力的理論工具。但過多的計算資源消耗阻礙了這個方法在冷凍電鏡單顆粒重構中的廣泛應用，如何在加快計算速度的同時，提高模型重構的準確性是大似然估計算法的一個重要問題。

Cryo-EM在結構生物學的應用

案例1：2019-nCoV病毒

從歷史維度上看，冷凍電鏡技術在結構生物學領域的功勛建樹無需贅述。2020年新型冠狀（2019-nCoV）病毒疫情席卷全球，冷凍電鏡技術在解析病毒結構、推測其侵染人體細胞的路徑等傳播原理發(fā)揮了重要作用。

病毒要進入人體細胞，就必須與人體細胞上相應的受體蛋白結合。新冠肺炎疫情暴發(fā)以來，新冠病毒表面與宿主細胞作用的關鍵刺突蛋白（S蛋白，Spike glycoprotein）備受各研究團隊的重視。得克薩斯大學的McLellan研究組采用冷凍電鏡技術，獲得純化S蛋白的3207張照片，結合已經公開的新冠病毒序列，獲得了經過3D重建的分辨率為3.5 ?的S蛋白三聚體結構。

發(fā)現2019-nCoV的S蛋白整體結構與SARS病毒S蛋白的整體結構相似，各個結構之間具有高度同源性。它們之間大的差異是RBD在其各自的"向下"結構中的位置差異。

結合冷凍電鏡獲取的病毒結構與表面等離子共振技術（SPR）的分析結果，研究團隊表明，新冠病毒的S蛋白結合人體ACE2（宿主細胞受體血管緊張素轉化酶2）的親和力要遠高于嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）的S蛋白，這解釋了為什么新冠病毒傳染性要比SARS病毒強得多。

案例2：生命剪接體

Cryo-EM別適用于解析難以結晶的大分子復合物的高分辨率三維結構。通過在近生理狀態(tài)下觀察蛋白質和其他生物大分子，Cryo-EM 揭示了它們的功能和動態(tài)變化。如圖2所示，中國科學院院士施一公教授團隊利用冷凍電鏡技術得到了關于近原子分辨率的生命剪接體三維結構。

案例3：GCGR蛋白

2020年，在Science上發(fā)表了一篇G蛋白偶聯受體（GPCR）-GCGR蛋白的結構信息，該蛋白的結構解析工作由青云瑞晶的技術人員完成。

G蛋白偶聯受體（GPCR）屬于膜蛋白，膜蛋白的膜內區(qū)域具有廣泛的疏水表面，從膜上解離下來后在極性的水溶液中難以穩(wěn)定存在，往往無法使用常規(guī)的結晶方法獲得其結構信息。該研究通過冷凍電鏡單顆粒法解析了GCGR與其同源配體胰高血糖素和異源三聚體Gs或Gi1蛋白的結構，以研究GCGR與G蛋白相互作用的分子機制。