腫瘤免疫治療：pMHC限制性抗體(TCRm)的獲得策略

類似于T細(xì)胞受體(TCR)的方式識別MHC呈遞腫瘤抗原的單克隆抗體(mAbs)，在腫瘤免疫治療方面具有巨大的潛力。然而，由于抗體沒有進(jìn)化出αβ-TCRs結(jié)構(gòu)上細(xì)微差別的p-MHC限制，分離TCRm抗體是費(fèi)力的。這里提出了一種策略，通過重新設(shè)計(jì)預(yù)選的抗體，以與傳統(tǒng)的αβ-TCRs結(jié)構(gòu)相似的方式與p-MHC結(jié)合，快速分離高度多肽特異和MHC限制性的抗體。創(chuàng)建了以TCRm抗體CDR環(huán)的肽相互作用殘基為重點(diǎn)的結(jié)構(gòu)文庫，并快速生成針對小鼠和人類腫瘤抗原的MHC限制性抗體，當(dāng)形成IgG、雙特異性T細(xì)胞結(jié)合蛋白(BiTE)和CAR-T時(shí)，這些抗體可以特異性地殺傷靶細(xì)胞。對選定的pMHC限制性抗體的晶體分析顯示了高度的多肽特異性識別，驗(yàn)證了工程策略。這種方法可以在幾周內(nèi)產(chǎn)生腫瘤抗原特異性抗體，有可能實(shí)現(xiàn)快速臨床轉(zhuǎn)化。

單抗(mAbs)是一種有效的治療藥物，因?yàn)樗哂懈哂H和力和靶標(biāo)特異性，并且具有類藥物的特性。針對MHC蛋白提呈的多肽腫瘤抗原的單抗，稱為TCR-Mimic(TCRm)抗體，是一種新興的免疫治療手段，能夠識別腫瘤細(xì)胞表面低水平表達(dá)的多種腫瘤抗原。這種TCRm單抗可以以多種形式用來實(shí)現(xiàn)不同的靶向殺傷，包括用于ADC和/或ADCC(抗體依賴性細(xì)胞毒性)的IgG、BiTEs和CAR-T的背景下。然而，抗體和αβ-TCR在識別其靶標(biāo)的方式上進(jìn)化了根本的結(jié)構(gòu)差異，這限制了當(dāng)前的TCRm技術(shù)?？贵w利用CDR3的多樣性和體細(xì)胞超突變，通過所有6個(gè)CDR環(huán)實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)靶標(biāo)表面的高親和力。相比之下，由于pMHC表面的復(fù)合性質(zhì)，αβ-TCR使用一種更細(xì)微的、MHC受限的識別方案。TCR主要使用胚系來源的CDR1和CDR2以極低的親和力與MHC螺旋結(jié)合，而CDR3環(huán)的聚焦遺傳多樣性在很大程度上與MHC溝中結(jié)合的多肽抗原的‘up-facing’氨基酸殘基結(jié)合。MHC螺旋識別和多肽專一性之間的這種微妙的能量平衡使TCR能夠在稱為掃描的過程中精細(xì)地區(qū)分不同的自體和異源多肽。抗體結(jié)合位點(diǎn)沒有進(jìn)化為pMHC表面的抗原特異性識別。分離與pMHC表面高親和力和完全多肽選擇性結(jié)合的MHC限制性抗體是一項(xiàng)困難的技術(shù)挑戰(zhàn)，既耗時(shí)又得率低。

目前可用于分離TCRm抗體的技術(shù)不能解釋抗體和TCR介導(dǎo)的抗原識別之間的結(jié)構(gòu)能量差異。TCRm抗體一般通過常規(guī)方法分離，如小鼠雜交瘤和噬菌體展示文庫技術(shù)。在每種情況下，都必須對每個(gè)pMHC靶標(biāo)進(jìn)行從頭篩選。由于Abs與pMHC上的任何表位結(jié)合，與TCR不同，Abs不會自然偏向于與復(fù)合肽和MHC表面結(jié)合，這只占可結(jié)合的總pMHC表面的一小部分，因此命中率很低。然而，這些方法已經(jīng)成功地鑒定了多肽特異性的TCRm抗體。然而，脫靶MHC反應(yīng)的前景仍然取決于TCRm對接模式是否偏離平衡并且顯示MHC螺旋接觸的優(yōu)勢。TCRm抗體的這種pMHC結(jié)合模式可以與MHC螺旋具有相當(dāng)大的結(jié)合能，從而使它們易于與健康組織上的自身pMHC發(fā)生不必要的反應(yīng)。

分離TCRm抗體的另一種方法是專注于已知的以“常規(guī)的”TCR-like方式與pMHC結(jié)合的抗體。在這里，標(biāo)準(zhǔn)將是結(jié)合到pMHC類似于已知的典型的對角線‘足跡’中看到的大多數(shù)α-β TCR與MHC的復(fù)合體。這種足跡的特點(diǎn)在于，來自Vα和Vβ的種系編碼的TCR CDR1和CDR2通常與MHC螺旋接觸，以建立MHC特異性，而CDR3環(huán)詢問MHC溝的中心是否有結(jié)合肽，盡管這有很大的差異。這一總體結(jié)構(gòu)框架為TCRm抗體提供了一種理想的識別模式，但在實(shí)踐中，通過前面提到的從頭篩選方法很難識別它們。例如，即使已經(jīng)被建立為肽特異性的TCRm抗體也可以表現(xiàn)出替代的、不希望看到的結(jié)合模式，主要是與MHC螺旋接觸，顯示出非TCR-like足跡。然而，存在以與TCRs幾乎相同的結(jié)合模式與pMHC結(jié)合的TCRm抗體的結(jié)構(gòu)例子，這可以被TCRm重新利用。

這里提出了一種快速、集中分離MHC限制性TCRm抗體的策略，方法是使用現(xiàn)有的與pMHC以TCR-like結(jié)合的TCRm抗體作為起始工程模板，然后，通過將文庫專門集中在與肽接觸的TCRm抗體CDR殘基上，同時(shí)保留MHC接觸，可以選擇基本上受MHC限制的TCRm抗體文庫。然后，這些文庫可以在幾周內(nèi)針對同一MHC等位基因呈遞的不同肽進(jìn)行快速重新選擇。這里介紹了這些文庫的開發(fā)，針對一系列小鼠和人類腫瘤抗原的pMHC特異性的重新設(shè)計(jì)，以及這些TCRm抗體隨后通過ADCC以TCRm-BiTE和CAR-T形式殺死腫瘤細(xì)胞的能力。給出了一種重新設(shè)計(jì)的人TCRm抗體的結(jié)構(gòu)驗(yàn)證，由于這種選擇策略，它表現(xiàn)出了對MHC選擇性的增強(qiáng)。通過從偏向MHC的模板開始，這項(xiàng)技術(shù)足夠快速，能夠?qū)€(gè)體患者的新抗原進(jìn)行實(shí)時(shí)臨床應(yīng)用。

小鼠TCRm scFv文庫的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

研究TCRm抗體與小鼠p-MHC分子的現(xiàn)有晶體結(jié)構(gòu)，并鑒定了一種TCRm抗體25-D1.16(PDB:3CVH)，它以TCR-like的對接模式與OVA/H2-Kb結(jié)合，從而顯示出理想的識別性能。該抗體與傳統(tǒng)的TCR/pMHC對接足跡顯示非常一致，其中CDR3主要(但不完全)集中在多肽上，而CDR1和2則集中在MHC螺旋上。選擇25-D1.16作為scFv酵母展示文庫的起始模板。在文庫創(chuàng)建之前，在酵母表面展示了25-D1.16 scFv，以驗(yàn)證與OVA/H2-Kb tetramer的結(jié)合。25-D1.16 scFv顯示酵母可被呈現(xiàn)OVA(SIINFEKL)肽的H2-Kb tetramer特異性染色，表明scFv已正確折疊，是構(gòu)建文庫的良好起點(diǎn)。

在文庫設(shè)計(jì)中，只隨機(jī)化了25-D1.16 Ab CDR環(huán)上與OVA肽接觸的氨基酸位置，而不修改與MHC接觸的殘基。這里是邏輯是，如果隨后選擇該文庫針對除OVA以外的H2-Kb提呈肽，并且抗體的MHC結(jié)合殘基完整，則該文庫將被賦予一定程度的H2-Kb偏向。目標(biāo)是允許對接轉(zhuǎn)移以適應(yīng)新的多肽相互作用，但仍然受到MHC的限制。通過對25-D1.16-OVA/H2-Kb結(jié)構(gòu)的分析，在H2-Kb呈遞的 OVA多肽的4?（?是晶體學(xué)、原子物理、超顯微結(jié)構(gòu)等常用的長度單位，1?=10^-10m，nm的1/10）內(nèi)鑒定了9個(gè)抗體殘基。然后，通過在這9個(gè)殘基中引入簡并的三聚體密碼子突變，建立了一個(gè)多樣性約為5×10^8的文庫。

小鼠TCRm抗體的篩選及結(jié)合特性研究

作為一個(gè)新的靶點(diǎn)，選擇了一個(gè)表征良好的小鼠腫瘤抗原Trp2 (SVYDFFVWL) (180-188)，它是由H2-Kb呈遞的小鼠B16黑色素瘤表達(dá)的。對偏向TCRm scFv文庫進(jìn)行了酵母展示選擇，以Trp2/H2-Kb tetramer染色。經(jīng)過四輪Trp2/H2-Kb選擇和一輪OVA/H2-Kb負(fù)選擇后，scFv文庫對Trp2/H2-Kb特異地富集，但對OVA/H2-Kb沒有。第四輪scFv文庫篩選進(jìn)一步用Trp/H2-Kb tetramer進(jìn)行FACS分選，以富集高親和力結(jié)合蛋白。選擇了4個(gè)識別Trp2/H2-Kb的克隆進(jìn)行進(jìn)一步分析。由于克隆?13對Trp2/H2-Kb復(fù)合體表現(xiàn)出高的親和力，因此選擇它進(jìn)行進(jìn)一步分析。對Trp2多肽進(jìn)行了丙氨酸掃描，結(jié)果顯示TCRm Ab對中心位置的P5和P6殘基具有高度特異性，證實(shí)了文庫設(shè)計(jì)保留了親本TCRm Ab的多肽位置選擇性?？寺?13，當(dāng)被變?yōu)?/span>scFv和IgG重組蛋白時(shí)，能夠以肽劑量依賴的方式與Trp2肽脈沖的H2-Kb+EL4細(xì)胞特異性結(jié)合，檢測到少的本底結(jié)合。

Trp2/H2-Kb TCRm抗體的功能鑒定

目前還沒有關(guān)于小鼠腫瘤抗原的TCRm的報(bào)道，這提供了探索治療方式的機(jī)會，并將克隆13 TCRm抗體作為成像工具嘗試量化該腫瘤抗原在B16F10細(xì)胞上的表達(dá)水平。鑒于需要仔細(xì)定量，使用B16F10靶細(xì)胞和表達(dá)活化T細(xì)胞核因子(NFAT)報(bào)告基因的mFcγRIV的小鼠效應(yīng)細(xì)胞來替代ADCC，以大限度地減少原代細(xì)胞ADCC檢測的變異性。為了大限度地提高TCRm抗體的ADCC報(bào)告基因活性，生成具有工程化Fc的小鼠IgG2a變體：野生型mIgG2a、帶有L234A/L235A/P329G(LALAPG)突變的mIgG2a、以及帶有S239D/I332E(DE)突變的mIgG2a，都已知能增強(qiáng)ADCC。雖然所有的IgG都顯示出同等的結(jié)合活性，但只有DE變體對IFN-γ處理的Trp2多肽脈沖的B16F10細(xì)胞顯示出ADCC報(bào)告活性，并且ADCC報(bào)告活性與mIgG2a(DE)濃度密切相關(guān)，半數(shù)大有效濃度約為15ng/ml。

在沒有IFN-γ和多肽脈沖的情況下，B16F10上缺乏強(qiáng)大的ADCC報(bào)告活性，這突顯了像許多腫瘤抗原一樣，內(nèi)源性表達(dá)的Trp2的低表達(dá)水平。針對Trp2/H2-Kb的高親和力TCRm的獲得能夠使用全內(nèi)反射熒光(TIRF)顯微鏡來檢測B16F10細(xì)胞表面Trp2抗原的表達(dá)水平。試圖在單分子水平上量化佳ADCC所需的Trp2/H2-Kb細(xì)胞表面表達(dá)水平。為此，設(shè)計(jì)了一種帶有ALFA標(biāo)簽的mIgG2a13 (mIgG2a13-ALFA)，使其能夠用抗ALFA標(biāo)記的NBs原位標(biāo)記細(xì)胞表面，它與ALFA與皮摩爾親和力結(jié)合。根據(jù)IFN-γ和/或Trp2肽的處理，觀察到單個(gè)mIgG2a13-ALFA與細(xì)胞表面Trp2/H2-Kb結(jié)合，它們隨機(jī)擴(kuò)散到質(zhì)膜中。經(jīng)IFN-γ和Trp2多肽處理后，mIgG2a13-ALFA的細(xì)胞表面密度由未處理細(xì)胞的＜0.05μm-2增加到約0.8 μm-2。用相同濃度的Trp2多肽進(jìn)行了劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，以滴定每個(gè)B16F10細(xì)胞表達(dá)的Trp2/H2-Kb分子的數(shù)量和可測量的ADCC報(bào)告活性。觀察到，在加入Trp2后，B16F10細(xì)胞上Trp2密度隨劑量的增加而增加，這與ADCC報(bào)告基因的劑量反應(yīng)密切相關(guān)。估計(jì)在+peptide/+IFN-γ條件下，ADCC所需的每個(gè)細(xì)胞小Trp2分子數(shù)量約為1000-2000 Trp2。在沒有添加多肽或IFN-γ的B16F10細(xì)胞上，估計(jì)每個(gè)細(xì)胞表達(dá)＜100 Trp2/H2-Kb分子，但IFN-γ劑量滴定使這一數(shù)字增加到約800-1000，導(dǎo)致適度的ADCC報(bào)告基因激活。

鑒于TCRm在誘導(dǎo)針對低表達(dá)腫瘤抗原的有效ADCC方面的局限性，試圖探索Trp2特異性TCRm抗體的其他形式，這些模式可能更有效地限制抗原劑量。因此，生成了一個(gè)TCRm雙特異性T 細(xì)胞結(jié)合器(TCRm-BiTE)，包括Trp2/H2-Kb TCRm scFv克隆13和2C11 anti-CD3e scFv，以將T 細(xì)胞招募到腫瘤細(xì)胞。首先證明了TCRm-BiTE可以劑量依賴的方式殺死不表達(dá)Trp2的Trp2多肽脈沖的EL4細(xì)胞，驗(yàn)證了TCRm-BiTE的活性。然后，遵循在ADCC和成像試驗(yàn)中建立的實(shí)驗(yàn)條件，在存在和/或不存在Trp2多肽和IFN-γ的情況下檢測B16F10的殺傷作用。TCRm-BiTE在沒有脈沖肽或IFN-γ預(yù)處理的情況下，即使在內(nèi)源性條件下也表現(xiàn)出對B16F10細(xì)胞的強(qiáng)烈細(xì)胞毒活性還仔細(xì)評估了單獨(dú)的anti-CD3e 2C11 scFv和BiTE非特異性作用，發(fā)現(xiàn)2C11 scFv單獨(dú)對B16F10以及多肽脈沖的EL4和MC38細(xì)胞株有微弱的殺傷作用，表明2C11可以引起某種程度的非特異性殺傷活性，與BiTE的TCRm scFv部分無關(guān)?？傊C明了TCRm-BiTE能夠通過對Trp2等極低密度抗原的特異性識別而觸發(fā)B16F10腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞溶解。

還探索TCRm抗體在以CAR-T形式呈現(xiàn)時(shí)的實(shí)用性。用scFv克隆13替換anti-CD19 CAR-T構(gòu)建體中的scFv，將其克隆到GFP+ CAR盒中，并進(jìn)行了體外腫瘤殺傷實(shí)驗(yàn)。用scFv13 CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠T 細(xì)胞與B16F10細(xì)胞以效靶比1:1、3:1和10:1孵育，DAPI染色檢測B16F10細(xì)胞死亡情況。對B16F10細(xì)胞的殺傷從E:T=1:1開始，在沒有IFN-γ處理的情況下在10:1達(dá)到大值，這表明scFv13 CAR即使在天然低抗原密度(每個(gè)細(xì)胞＜100 分子)的情況下也能對B16F10細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)。用IFN-