中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在腦缺血再灌注損傷中的作用

腦卒中是由于腦梗死、腦出血或蛛網(wǎng)膜下腔出血導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性損傷，是世界范圍內(nèi)死亡和致殘的主要原因，腦卒中包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中的發(fā)病率高于出血性腦卒中，約占腦卒中總數(shù)的70%。近年來，靜脈溶栓的普及和血管內(nèi)治療的開展給缺血性腦卒中患者帶來希望，但血管再通后缺血性腦卒中區(qū)域血供的恢復(fù)會(huì)引起一系列不良的生化反應(yīng)，包括活性氧的產(chǎn)生、炎癥反應(yīng)、腦細(xì)胞損傷等，導(dǎo)致受損部位神經(jīng)元凋亡或壞死，加重患者缺血區(qū)域腦組織損傷和腦功能障礙，造成腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI）。

中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（mesencephalic astrocyte?derived neurotrophic factor, MANF）是一種進(jìn)化保守的神經(jīng)營養(yǎng)因子，屬于腦多巴胺神經(jīng)營養(yǎng)因子/MANF家族。既往研究表明，MANF在神經(jīng)性系統(tǒng)疾?。廴缗两鹕。≒arkinson's disease, PD）、阿爾茨海默病以及CIRI］中起著不可或缺的作用。本文就MANF的功能以及在CIRI中的作用及可能的作用機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步探尋CIRI的防治方法提供新方向。

1、MANF的特性與功能

MANF是一種分泌蛋白，相對分子質(zhì)量約為18×103，在細(xì)胞內(nèi)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum, ER）和高爾基體，人類和鼠的腦、肝、心臟、脾、肺以及骨骼肌等組織中都有不同程度的表達(dá)，其中，腦組織中主要見于大腦皮質(zhì)、海馬、小腦浦肯野細(xì)胞以及丘腦和下丘腦。MANF由于獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，除了與傳統(tǒng)的神經(jīng)營養(yǎng)因子一樣可激活細(xì)胞內(nèi)信號通路，調(diào)控神經(jīng)元結(jié)構(gòu)、功能和生存，在神經(jīng)元的生長、存活和成熟中發(fā)揮關(guān)鍵作用外，還參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress, ERS）以及調(diào)控炎癥反應(yīng)等病理生理過程，具有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡等活性。

1.1、神經(jīng)修復(fù)與保護(hù)作用

有學(xué)者通過向PD模型小鼠黑質(zhì)內(nèi)注射腺相關(guān)病毒血清8型載體?MANF重組體發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)MANF蛋白改善了PD大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙，并抑制了多巴胺能神經(jīng)元的變性。也有研究表明，PD大鼠顱內(nèi)過表達(dá)MANF，在黑質(zhì)內(nèi)促進(jìn)了多巴胺能神經(jīng)元的存活，在紋狀體內(nèi)促進(jìn)了多巴胺能神經(jīng)纖維的再生，上調(diào)了機(jī)體內(nèi)多巴胺的水平，并且長期（長達(dá)16周）改善了PD大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，推測外源性MANF對PD大鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺系統(tǒng)有長期的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生作用。

Zhang等在PD α?突觸核蛋白模型多巴胺能神經(jīng)元中特異性過表達(dá)MANF，也發(fā)現(xiàn)MANF可改善多巴胺能神經(jīng)元的纖毛、樹突、軸突存活率以及細(xì)胞核形態(tài)，緩解進(jìn)行性神經(jīng)元退行性變并預(yù)防運(yùn)動(dòng)缺陷；此外，MANF還可降低α?突觸核蛋白的聚集，恢復(fù)多巴胺水平，并挽救受損多巴胺能神經(jīng)元的功能，發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。另外，Wen等通過腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)過表達(dá)MANF或在培養(yǎng)基中加入重組人MANF蛋白發(fā)現(xiàn)，外源性MANF可促進(jìn)維甲酸處理的N2a細(xì)胞神經(jīng)突的生長。

1.2、參與ERS

ERS是ER內(nèi)穩(wěn)態(tài)亞細(xì)胞損傷的病理過程，也是真核細(xì)胞的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)。諸如缺血再灌注、營養(yǎng)不足、脂質(zhì)過度負(fù)荷、鈣濃度變化以及氧化應(yīng)激等生理病理情況均能誘導(dǎo)ER內(nèi)蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，誘發(fā)ERS。未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response, UPR）是一種通過抑制蛋白質(zhì)翻譯以及降解錯(cuò)誤折疊蛋白的途徑來緩解應(yīng)激的細(xì)胞防御機(jī)制，有助于恢復(fù)ER的穩(wěn)態(tài)，ERS可以觸發(fā)UPR的激活，但ER的壓力如果長期維持在高水平，UPR將會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Li等通過在PD體外模型上敲低MANF發(fā)現(xiàn)，C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein, CHOP）、免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein, Bip）和活化胱天蛋白酶?3蛋白表達(dá)明顯增加，細(xì)胞活力明顯降低，表明內(nèi)源性MANF可通過抑制ERS和細(xì)胞凋亡緩解PD的神經(jīng)元損傷。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，外源性MANF能促進(jìn)正常和糖尿病患者角膜上皮創(chuàng)面愈合和神經(jīng)再生，并且在小鼠結(jié)膜下注射MANF特異性干擾小RNA也可以阻止角膜上皮傷口愈合和神經(jīng)再生，推測外源性和內(nèi)源性MANF均能抑制高血糖誘導(dǎo)的ERS以及ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，Wang等研究報(bào)道，對特異性中樞神經(jīng)系統(tǒng)MANF基因敲除的小鼠皮下注射乙醇和ERS誘導(dǎo)劑衣霉素（tunicamycin, TM）構(gòu)建神經(jīng)退行性變動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)MANF缺乏會(huì)加劇乙醇及TM誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡和ERS，而利用ERS抑制劑4?PBA阻斷ERS可以消除這種有害作用，這些結(jié)果表明內(nèi)源性MANF可以通過改善ERS來保護(hù)神經(jīng)元免受乙醇誘導(dǎo)的神經(jīng)退化。Tang等研究發(fā)現(xiàn)，小鼠促阿片?黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原神經(jīng)元中的MANF敲低后，觸發(fā)了ERS，并激活了下丘腦中UPR信號，引起ERS標(biāo)志物（GRP78等）表達(dá)水平上調(diào)；而過表達(dá)MANF則可減弱ERS，進(jìn)而刺激交感神經(jīng)和棕色脂肪組織的活性，導(dǎo)致棕色脂肪組織產(chǎn)熱增加，這表明內(nèi)源性和外源性MANF可通過抑制ERS保護(hù)小鼠免受膳食肥胖的影響。

1.3、抑制炎癥反應(yīng)

NF?κB是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在炎癥的起始階段起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。MANF在自身免疫性疾病和炎癥疾病中上調(diào)，并且炎癥可使MANF由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮其抗炎、抗凋亡作用。研究表明，MANF可能通過其C端SAP樣結(jié)構(gòu)域與p65結(jié)合，從而抑制NF?κB的激活，減輕脂肪細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。Yan等通過小鼠肝臟特異性MANF敲除發(fā)現(xiàn)，小鼠的肝臟脂肪變性和炎癥加重，而肝臟特異性MANF過表達(dá)則減輕了炎癥反應(yīng)，體外試驗(yàn)也得到同樣結(jié)果，提示內(nèi)源性和外源性MANF可通過抑制NF?κB信號通路對非酒精性脂肪性肝炎起到保護(hù)作用。Hou等發(fā)現(xiàn)，利用脂多糖誘導(dǎo)小鼠發(fā)生急性腎損傷后，單核巨噬細(xì)胞特異性MANF敲除的小鼠生存率較低、血清TNF?α水平較高、腎損傷更嚴(yán)重、腎組織中M1型巨噬細(xì)胞增多，推測這可能與腎臟微環(huán)境中NF?κB信號通路的激活增強(qiáng)有關(guān)，表明MANF可通過抑制NF?κB信號通路減輕腎臟炎癥，對脂多糖誘導(dǎo)的急性腎損傷起到保護(hù)作用。Sun等也發(fā)現(xiàn)，用外源性MANF治療小鼠皮膚炎癥損傷后，血清TNF?α、IL?1β表達(dá)降低，IL?10表達(dá)增加，表明外源性MANF可減輕皮膚炎癥。

2、MANF在CIRI中的作用

2.1、CIRI

CIRI發(fā)生在缺血性腦卒中后的短時(shí)間內(nèi)，腦組織功能由于缺血缺氧而受損，在恢復(fù)血液灌注后會(huì)再次對腦組織造成傷害，使腦組織的損傷程度進(jìn)一步加重。CIRI的腦組織損傷既取決于血流減少程度，還與細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用、一氧化氮合成過多、能量代謝障礙、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和壞死等因素有關(guān)，導(dǎo)致CIRI的諸多因素或環(huán)節(jié)相互影響或互為因果，共同作用產(chǎn)生神經(jīng)毒性，引起局部腦組織功能損傷。

2.2、MANF在CIRI中的作用

Caglayan等在小鼠腦卒中后3 d開始給予腦室內(nèi)MANF治療，持續(xù)28 d，通過一系列行為學(xué)測試評估發(fā)現(xiàn)，外源性MANF可促進(jìn)腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)，提高神經(jīng)元長期存活率，緩解缺血性損傷，減少遲發(fā)性腦萎縮和神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成。Han等在小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）后2 h向缺血側(cè)腦室注射重組人MANF蛋白，發(fā)現(xiàn)外源性MANF可抑制腦梗死區(qū)IL?6、IL?1β以及TNF?α的產(chǎn)生，恢復(fù)血腦屏障的完整性，從而降低梗死體積、神經(jīng)評分、腦水含量和中性粒細(xì)胞浸潤率。M?tlik等在大鼠MCAO模型中也發(fā)現(xiàn)，腦卒中后2~3 d，在腦梗死灶周圍區(qū)域過表達(dá)重組人MANF蛋白，降低了神經(jīng)功能缺損評分，促進(jìn)了大鼠的功能恢復(fù)，但并不影響腦梗死灶的體積；另外，MANF基因敲除小鼠MCAO后腦梗死體積增大，表明外源性和內(nèi)源性MANF對腦缺血性損傷都具有神經(jīng)修復(fù)和保護(hù)作用。

3、可能作用機(jī)制

3.1、抑制ERS和細(xì)胞凋亡

Yang等建立大鼠MCAO模型發(fā)現(xiàn)，MCAO引起UPR相關(guān)基因XBP1（包括XBP1u和XBP1s上調(diào)，MCAO后2 h于缺血側(cè)腦室注射重組人MANF蛋白，抑制了局灶性腦缺血引起的Bip、磷酸化肌醇需求酶和XBP1的升高，但不影響CHOP的表達(dá)，提示UPR可能參與了MANF的神經(jīng)保護(hù)作用，這表明MANF可通過調(diào)節(jié)ERS和UPR相關(guān)基因的表達(dá)來保護(hù)神經(jīng)元，減少神經(jīng)元凋亡。Yang等對MCAO大鼠缺血側(cè)腦室注射外源性MANF蛋白治療偏癱大鼠，發(fā)現(xiàn)CIRI引起的胱天蛋白酶?3裂解受到抑制，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量也減少，表明MANF可能通過抑制細(xì)胞凋亡對缺血區(qū)域大腦皮質(zhì)起到保護(hù)作用。Yu等利用重組人MANF蛋白預(yù)處理原代培養(yǎng)的神經(jīng)元，在TM處理后發(fā)現(xiàn)，MANF預(yù)處理的神經(jīng)元中TUNEL陽性細(xì)胞更少，表明MANF能減輕ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。孫瑞對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH?SY5Y進(jìn)行糖氧剝奪/再灌注（oxygen?glucose deprivation/reperfusion, OGD/R），在給予重組人MANF蛋白后發(fā)現(xiàn)，由OGD/R上調(diào)的CHOP和胱天蛋白酶?3裂解水平被抑制，表明MANF可通過抑制ERS引起的細(xì)胞凋亡進(jìn)而改善OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。Tseng等給予MANF基因敲除小鼠的神經(jīng)干細(xì)胞OGD/R處理發(fā)現(xiàn)，MANF敲除的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率更高，而給予重組人MANF蛋白后，緩解了OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明內(nèi)源性和外源性MANF均可保護(hù)神經(jīng)干細(xì)胞免受OGD/R誘導(dǎo)的損傷，抑制細(xì)胞凋亡。

3.2、抑制炎癥反應(yīng)

研究發(fā)現(xiàn)，外源性MANF在細(xì)胞核內(nèi)通過其C端類SAP樣結(jié)構(gòu)域與NF?κB p65亞基的DNA結(jié)合域相互作用，從而干擾p65與其靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合，抑制p65介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活，因此MANF始終抑制NF?κB依賴的靶基因表達(dá)和炎癥滑膜細(xì)胞增殖，這一發(fā)現(xiàn)表明，MANF可能是炎癥的負(fù)調(diào)控因子。在CIRI中，炎癥反應(yīng)也參與了缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。Han等在MCAO小鼠缺血側(cè)腦室注射重組人MANF蛋白發(fā)現(xiàn)，腦梗死灶周圍區(qū)域IL?6、IL?1β和TNF?α的產(chǎn)生減少，維持了血腦屏障的完整性，進(jìn)而降低梗死體積、神經(jīng)系統(tǒng)評分、腦含水量和中性粒細(xì)胞浸潤率。Caglayan等也發(fā)現(xiàn)，小鼠CIRI后3 d向缺血側(cè)腦室內(nèi)連續(xù)微泵注入MANF蛋白后，降低了小鼠腦內(nèi)促炎因子IL?1β和TNF?α的mRNA表達(dá)，抑制了炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了神經(jīng)元的長期存活，減少了延遲性腦萎縮和神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的形成。另外，有研究報(bào)道稱中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性損傷可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，并釋放促炎細(xì)胞因子，如TNF?α、IL?1β和IL?6等。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，外源性MANF能減少OGD誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中IL?1β、IL?6、TNF?α的分泌和mRNA表達(dá)的升高，抑制GRP78和NF?κB p65的上調(diào)，從而減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷，增強(qiáng)細(xì)胞活力。

3.3、調(diào)節(jié)免疫功能并促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化

M?tlik等發(fā)現(xiàn)，腦卒中后給予外源性MANF治療可加速改善缺血性腦損傷大鼠的行為缺陷，增加皮質(zhì)下巨噬細(xì)胞的數(shù)量，通過基因分析發(fā)現(xiàn)MANF誘導(dǎo)腦梗死灶周圍皮質(zhì)補(bǔ)體C3和Emr1基因表達(dá)上調(diào)，這兩種基因都在小膠質(zhì)細(xì)胞和外周免疫細(xì)胞（特別是單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞）中表達(dá)，表明MANF對梗死灶周圍組織的保護(hù)作用可能與免疫功能有關(guān)。Yang等研究發(fā)現(xiàn)，利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療腦卒中大鼠后，MANF表達(dá)上調(diào)，可直接誘導(dǎo)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化，促進(jìn)大鼠受損的神經(jīng)功能恢復(fù)，減少腦梗死體積，表明MANF在大鼠CIRI中通過免疫調(diào)節(jié)作用修復(fù)腦組織損傷。

Tseng等在體外培養(yǎng)的特異性MANF基因敲除小鼠的腦室下區(qū)片段中發(fā)現(xiàn)，OGD/R后內(nèi)源性MANF可促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞的遷移；在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入外源性MANF蛋白發(fā)現(xiàn)，可促進(jìn)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的分化，從而增加成神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量，表明MANF的神經(jīng)再生活性有助于神經(jīng)祖細(xì)胞的遷移和神經(jīng)干細(xì)胞分化，從而增加腦卒中后大腦皮質(zhì)中成神經(jīng)細(xì)胞的聚集。

4、展望

MANF對多巴胺能神經(jīng)元有選擇性保護(hù)作用，在CIRI等中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病中保護(hù)神經(jīng)元免受損傷，因此MANF具有治療CIRI、PD和阿爾茨海默病等多種神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的潛力。MANF可通過抑制ERS、抗凋亡、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能等途徑降低CIRI的死亡率，改善神經(jīng)功能，減少腦梗死體積。但具體的作用機(jī)制尚未有定論，在廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)性疾病臨床治療之前，其安全性及作用機(jī)制還需要進(jìn)行大量的臨床前研究。隨著對MANF的進(jìn)一步研究，未來可能會(huì)為CIRI等神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的發(fā)病機(jī)制和防治方法提供新方向。