任何癌癥治療的目標都是靶向并殺死癌細胞，同時保留正常細胞。人類免疫系統(tǒng)T細胞受體TCR 對癌癥細胞突變的特異性識別可以實現(xiàn)這一目標。癌癥基因的突變改變了癌細胞表面主要組織相容性復(fù)合體 (MHC) 呈遞的肽的氨基酸序列，而TCR靶向胞內(nèi)靶點的受體可以區(qū)分癌癥基因組中的單點突變[1]。突變新抗原為過繼細胞轉(zhuǎn)移 (ACT) 療法的活性提供了主要靶標。之前的人類 T 細胞工程依賴于使用重組病毒載體，但為每位患者生成多個個性化臨床級載體是不可行的。由于CRISPR-Cas9的精確基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)[2]，無需使用病毒載體也可實現(xiàn)穩(wěn)定整合的基因表達。研究人員開發(fā)出新的轉(zhuǎn)基因靶向，使得T細胞具有重新定向到新突變抗原的能力。
Susan P. Foy[3]等人開發(fā)了一種基于 CRISPR-Cas9 、非病毒載體、能精確編輯基因組的臨床級治療方法，主要是通過該方法同時敲除兩個內(nèi)源性 TCR 基因TRAC（編碼 TCRα）和TRBC（編碼 TCRβ），還插入了從患者的循環(huán) T 細胞中分離出的新抗原特異性 TCR (neoTCR) 的兩條鏈。研究人員描述了一種能夠有效分離突變新抗原特異的多個 TCR 的方法如圖1。該策略使用由個體患者的 HLA I 類等位基因呈現(xiàn)的數(shù)百個預(yù)測的新抗原肽序列的個性化文庫和靶向的非病毒基因編輯方法，來重建分離的 neoTCR 的特異性?？偟膩碚f，這個省時的過程能夠產(chǎn)生用于ACT的臨床級neoTCR 轉(zhuǎn)基因 T 細胞制劑。
研究人員從患者來源的PBMCs建立好的T細胞庫文庫提取出識別新突變抗原的TCR序列，接下來自每個捕獲的 T 細胞的TRAC和TRBC基因被單細胞測序并克隆到同源重組 (HR) DNA 質(zhì)粒中。這些 HR 質(zhì)粒與位點特異性核酸酶一起用于敲除內(nèi)源性 TCRβ 鏈，并將轉(zhuǎn)基因TRAC和TRBC基因插入 CD8 和 CD4 T 細胞的內(nèi)源性TRAC位點（如圖2所示）。然后測試每個neoTCR候選物以識別同源新抗原或錯配的新抗原對照，以確認新抗原肽-HLA 特異性結(jié)合和干擾素-γ (IFNγ) 細胞因子分泌。重組的 neoTCR 與可溶性肽-HLA 復(fù)合物的結(jié)合實驗表明，在 127 個測試的 TCR 中，有 73 個 (57%) 是特異性且功能足夠的 neoTCR，可用于臨床治療選擇。臨床前概念驗證的數(shù)據(jù)則表明，使用我們的方法分離出的 neoTCR，然后將其改造到原代 T 細胞中，能夠特異性識別和殺死表達內(nèi)源性新抗原水平的腫瘤細胞。
經(jīng)過一系列篩選及構(gòu)建，接下來研究人員將 neoTCR 改造的 T 細胞輸注到患者體內(nèi)，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有患者都經(jīng)歷了 3-4 級全血細胞減少癥，這是由于淋巴細胞耗竭預(yù)處理方案導(dǎo)致的預(yù)期毒性。但有兩起毒性事件可能歸因于 neoTCR 轉(zhuǎn)基因 T 細胞療法。一共11 名患者出現(xiàn)疾病進展PD，其中5 名患者在腫瘤評估（輸注后第 28 天）出現(xiàn)PD。其中兩名患者的一些目標病變的大小有所減小。這包括臨床試驗中的第一位患者，即劑量水平 1 組的 0010，其在第 28 天的目標病灶大直徑總和縮小了 17%。總之，這篇研究證明了使用基于 CRISPR 的基因敲除和基因敲入編輯將 T 細胞基因重定向到人類突變新抗原的能力，為實體瘤癌患者提供廣泛適用的、腫瘤特異性的、個性化的 T 細胞療法。用 neoTCR 替代內(nèi)源性 TCR 會導(dǎo)致 T 細胞僅對特定 HLA 呈遞的突變作出反應(yīng)，從而為 T 細胞工程改造和重定向至癌細胞提供安全靶點。通過對這種方法的可行性和安全性的證明，neoTCR 改造的 T 細胞可以進一步進行基因改造以增加其功能。
