腸道菌群通過PUFA相關(guān)神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)阿爾茨海默病的病理和認(rèn)知障礙

本研究旨在調(diào)查腸道生態(tài)失調(diào)在大腦炎癥中的作用及其對阿爾茨海默病(AD)發(fā)病機(jī)制的貢獻(xiàn)。本研究以年齡依賴性方式分析了3×Tg小鼠的腸道微生物群組成。生成了無菌3×Tg小鼠，并使用AD患者和年齡匹配的健康供體糞便樣本對無菌3×Tg小鼠進(jìn)行了再定植。微生物16S rRNA測序顯示擬桿菌富集。與SPF小鼠相比，GF 3×Tg小鼠的大腦淀粉樣蛋白β斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)病理明顯減少。海馬RNAseq顯示，在沒有腸道微生物群的情況下，3×Tg小鼠大腦中的炎癥通路和胰島素/IGF-1信號通路發(fā)生異常改變。代謝組學(xué)分析鑒定出多不飽和脂肪酸代謝產(chǎn)物及其氧化酶選擇性升高，對應(yīng)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥。與健康供體的微生物群移植相比，AD患者的腸道微生物組加劇了3×Tg小鼠的AD病理，與C/EBPβ/AEP途徑激活和認(rèn)知功能障礙相關(guān)。綜上所述，這些結(jié)果支持復(fù)雜的腸道微生物組是行為缺陷、小膠質(zhì)細(xì)胞活化和AD病理所必需的，腸道微生物組有助于AD小鼠模型的病理，人類微生物組的生態(tài)失調(diào)可能是AD的風(fēng)險因素。

結(jié)果

1 腸道微生物刺激了3×Tg小鼠的AD病理、認(rèn)知缺陷和小膠質(zhì)細(xì)胞活化

作者報道了老齡3×Tg小鼠的微生物群通過激活大腦中C/EBPβ/AEP信號通路加速了年輕3×Tg小鼠的AD病理，表明年齡依賴性微生物組的變化會影響AD病理。因此，微生物組組成的縱向研究對于發(fā)現(xiàn)影響宿主的微生物群落的變化是必要的。為了鑒定微生物群中促進(jìn)AD小鼠模型中生理或病理生理反應(yīng)的時間特征，我們利用3×Tg AD小鼠模型通過高通量測序分析生成了17個月的16S rRNA基因譜的時間序列。微生物組分析顯示，4、8、12和17月齡3×Tg小鼠的微生物組成存在不平衡。此外，主坐標(biāo)(PCoA)分析表明，3×Tg小鼠的微生物群與年輕野生型小鼠的微生物群明顯聚集。在門水平上，與4月齡WT相比，4、12和17月齡3×Tg小鼠中變形菌門的相對豐度增加。另一方面，厚壁菌門和藍(lán)藻的相對豐度逐漸降低，而8月齡和17月齡3×Tg小鼠中擬桿菌門的相對豐度則高于4月齡3×Tg小鼠。厚壁菌門的減少和擬桿菌門的增加與炎癥和不同疾病有關(guān)。此外，粘蛋白降解和誘導(dǎo)炎癥的瘤胃球菌物種在老齡3×Tg小鼠中的相對頻率增加。簡而言之，微生物組分析表明，老齡3×Tg小鼠體內(nèi)的微生物群發(fā)生了改變，其特征是有益抗炎細(xì)菌群落減少，隨后腸道促炎致病菌富集。

為了闡明腸道微生物群在AD發(fā)病機(jī)制中的作用，我們將GF重新衍生為3×Tg AD小鼠模型。平均而言，GF小鼠體重比同齡SPF小鼠輕。此外，由于腸道微生物組缺失，GF小鼠表現(xiàn)出盲腸增大，體重增加，盲腸內(nèi)容物呈深色，盡管它們的胃腸道長度仍與SPF小鼠相當(dāng)。GF小鼠糞便樣本的無菌狀態(tài)通過細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)一步驗證，細(xì)菌培養(yǎng)物未顯示可證明的細(xì)菌。與SPF 3×Tg小鼠相比，GF小鼠皮層中Aβ聚集物沉積和ThS(硫黃素S)免疫熒光(IF)共染色信號降低。此外，與SPF小鼠相比，用特異性T22單克隆抗體驗證的海馬過度磷酸化tau(AT8)和纖維tau包涵體也減少。定量顯示，與SPF小鼠相比，GF小鼠中的Aβ42(而非Aβ40)減少(圖1C)。這些觀察結(jié)果表明，當(dāng)腸道微生物群耗盡時，AD病理得到緩解。

盡管兩組小鼠大腦中BDNF水平相似，但高爾基染色顯示，與SPF小鼠相比，GF小鼠海馬神經(jīng)元中的樹突棘升高。同時，在Y迷宮中的行為表明，GF小鼠的空間記憶功能明顯優(yōu)于SPF小鼠。小膠質(zhì)細(xì)胞的成熟和激活與AD大腦的慢性神經(jīng)炎癥有關(guān)。在GF小鼠的皮層小膠質(zhì)細(xì)胞中，Iba-1染色顯示出直徑、分支和節(jié)點數(shù)量增加。小膠質(zhì)細(xì)胞的半自動定量形態(tài)測量三維測量顯示，與SPF小鼠相比，GF小鼠的這些小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化。因此，腸道微生物群促進(jìn)AD病理、認(rèn)知缺陷和小膠質(zhì)細(xì)胞激活。

2 腸道微生物激活C/EBPβ/AEP途徑，升高與PUFA代謝有關(guān)的促炎酶

我們的研究支持C/EBPβ/AEP信號通路在時空上調(diào)控AD病理。為了評估是否需要完整的腸道微生物組來刺激這一途徑，從而促進(jìn)AD的發(fā)病，我們進(jìn)行了免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)與SFP小鼠相比，GF 3×Tg小鼠大腦中的C/EBPβ/AEP信號減弱。隨后，AEP截短的tau N368和APP N585片段減少，與p-tau AT8和AT100活性降低相關(guān)。值得注意的是，與SPF小鼠相比，GF 3×Tg小鼠的Lox5，Cox1和Cox2水平明顯降低，這與先前的研究結(jié)果相吻合，即AA代謝途徑不僅是炎癥的核心網(wǎng)絡(luò)，也是工作記憶障礙導(dǎo)致AD發(fā)病的主要原因。正如預(yù)期的那樣，蛋白酶檢測顯示GF小鼠的AEP酶活性低于SPF小鼠，與活性AEP水平降低一致。由于C/EBPβ是IL-6的主要轉(zhuǎn)錄因子，因此，與SPF小鼠相比，GF小鼠中的IL-6濃度降低。qRT-PCR結(jié)果顯示，與SPF小鼠相比，GF小鼠的CEBPβ靶標(biāo)/AA通路基因略有降低(與RNAseq數(shù)據(jù)相對應(yīng)。然而，qRT-PCR數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計學(xué)意義，這可能是由于定量PCR(qPCR)分析的差異較大所致。

腦切片IF共染色顯示，GF小鼠與SPF小鼠相比海馬和皮層中C/EBPβ上調(diào)、AEP激活、Aβ積累、Tau N368片段化和p-Tau(AT8)減少，與GF小鼠中C/EBPβ/AEP信號減弱以及APP N585和Tau N368片段減弱一致。此外，GF小鼠大腦中5-Lox，Cox1和Cox2的IF活性明顯降低，與C/EBPβ信號減弱密切相關(guān)。因此，與SPF小鼠相比，GF小鼠的C/EBPβ/AEP信號和AA相關(guān)炎癥酶減少，這表明腸道微生物群通過激活C/EBPβ/AEP途徑調(diào)節(jié)這些效應(yīng)因子的表達(dá)。這些結(jié)果與先前的報道一致，即C/EBPβ作為這些AA相關(guān)炎癥酶的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。免疫組化(IHC)染色進(jìn)一步證實，與SPF小鼠相比，GF小鼠大腦中的Iba-1和AEP均降低，與皮層中Iba1和AEP IF共染色一致。因此，GF 3×Tg小鼠表現(xiàn)出C/EBPβ/AEP通路減弱和AA相關(guān)炎癥減弱。

3 腸道菌群提高炎癥代謝物并改變大腦中的炎癥和胰島素/IGF-1通路

為了評估腸道微生物組對AD相關(guān)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的整體影響，我們使用GF和SPF 3×Tg小鼠的海馬樣本進(jìn)行了無偏RNA測序，并通過RNA轉(zhuǎn)錄本的定量深度測序測量了全基因組mRNA表達(dá)譜。我們發(fā)現(xiàn)SPF和GF動物之間的mRNA譜和整體基因表達(dá)模式存在差異。通過主成分分析(PCA)對數(shù)據(jù)集中的主要方差來源進(jìn)行評估，顯示GF和SPF 3×Tg小鼠之間明顯分離。我們觀察到SPF 3×Tg小鼠與GF 3×Tg小鼠的1872個差異基因。在差異表達(dá)基因中，與GF 3×Tg小鼠相比，我們在SPF 3×Tg小鼠的海馬中觀察到載脂蛋白E的表達(dá)下調(diào)。接下來，利用GF和SPF 3×Tg小鼠之間海馬區(qū)差異表達(dá)基因，通過功能mRNA的聚類分析生成熱圖。值得注意的是，與GF 3×Tg小鼠相比，參與AA代謝途徑的基因，包括Hpgd、Ptges3、Ptges2和Cyp1b1，在SPF 3×Tg小鼠中差異表達(dá)(上調(diào)：Hpgd、Ptges3和Cyp1b1;下調(diào)：Ptges2)，這與我們的觀察結(jié)果相吻合，許多AA相關(guān)炎癥酶在GF小鼠中明顯減少。有趣的是，除了AA代謝途徑中改變的促炎基因外，RNAseq還顯示，與GF小鼠相比，SPF小鼠的胰島素信號及其相關(guān)的下游通路發(fā)生了異常改變。因此，我們通過免疫印跡檢測海馬胰島素信號，發(fā)現(xiàn)與SPF小鼠相比，GF小鼠的p-胰島素受體(IR)和p-IRS(IR底物)及其下游效應(yīng)物(包括p-Akt和p-MAPK和p-GSK活性)均增加。這些數(shù)據(jù)與先前的報道一致，即AD患者表現(xiàn)出進(jìn)行性腦胰島素抵抗和胰島素缺乏。

接下來，我們使用公共基因集(GO、KEGG和PANTHER)對海馬中差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，并確定了與凋亡、血清素和多巴胺、GABAnergic、谷氨酸和去甲腎上腺素途徑相關(guān)基因的變化。如圖所示，SPF小鼠中包括Tnf、Apaf1、Fasl等在內(nèi)的促凋亡基因增加，抗凋亡基因Bcl2l1降低，盡管SPF小鼠的Bax、Bad、Casp3等促凋亡基因也減少，表明SPF和GF小鼠之間不同途徑介導(dǎo)的細(xì)胞死亡效應(yīng)因子發(fā)生改變，