非血液來(lái)源的ctDNA臨床轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢(shì)與挑戰(zhàn)

1、概述●

“液體活檢”是指在生物液體（傳統(tǒng)上是血液）中發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物，可以對(duì)其進(jìn)行采樣，以提供患者及其潛在惡性腫瘤的臨床價(jià)值信息。迄今為止，大多數(shù)液體活檢研究都集中在基于血液的生物標(biāo)志物上，包括循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）和循環(huán)microRNA。各種研究證實(shí)了血漿ctDNA中檢測(cè)到的基因組改變與腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的基因組改變之間高度一致。然而，過(guò)去幾十年發(fā)表的數(shù)據(jù)表明，這些癌癥衍生的細(xì)胞和分子也可以在非血液生物流體中發(fā)現(xiàn)，包括腦脊液（CSF）、尿液、胸膜液和腹膜液。相對(duì)于血漿，大多數(shù)非血液樣品中的ctDNA與cfDNA的比率較高，這表明這些樣品可能不易被非腫瘤來(lái)源的DNA稀釋。在對(duì)某些液體（如尿液）進(jìn)行采樣時(shí)，獲得更大的樣品體積，既可以提取和分析更多的ctDNA，也可以提高靈敏度。

2、尿ctDNA●

尿液中的ctDNA由兩個(gè)不同的部分組成。第一個(gè)是經(jīng)腎腫瘤DNA（trtDNA），它來(lái)源于血漿，通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)進(jìn)入尿液，因此大小有限（通常<250 bp）。第二部分來(lái)源于直接從泌尿道脫落的腫瘤細(xì)胞（ucfDNA），并且由于不進(jìn)行腎濾過(guò)，可以具有更大的分子量。

對(duì)trtDNA臨床應(yīng)用的大多數(shù)研究來(lái)自非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者，測(cè)試EGFR和KRAS的突變，并可用于監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)和獲得性耐藥性的發(fā)展。trtDNA分析顯示了在幾種癌癥類(lèi)型中潛在的診斷效用，包括非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌和卵巢癌以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）淋巴瘤。另外，trtDNA作為一種監(jiān)測(cè)治療后疾病狀態(tài)的方法也已被研究。治療后的定期尿液采樣（可以在家中進(jìn)行，樣本通過(guò)郵寄返回）可以使患者早期發(fā)現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)，與定期門(mén)診就診的策略相比，患者的依從性更高。

膀胱癌、前列腺癌和腎癌發(fā)生在尿道內(nèi)，可將DNA片段直接釋放到尿液中。ucfDNA分析的非侵入性，加上早期證據(jù)表明檢測(cè)是可行的，增加了對(duì)其用于泌尿系癌癥早期檢測(cè)、尿路上皮癌患者疾病監(jiān)測(cè)和復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的興趣。

但尿液trtDNA測(cè)定法存在某些缺點(diǎn)，應(yīng)予以強(qiáng)調(diào)。首先，trtDNA必須通過(guò)腎小球，這將片段的分子量限制在<250 bp。其次，腎小球?yàn)V過(guò)率控制著尿液trtDNA積累的速率，并且可以是高度可變的，特別是在接受全身抗癌治療的患者中。另一個(gè)潛在的缺點(diǎn)是，排泄的大量尿液會(huì)對(duì)ctDNA產(chǎn)生稀釋作用。使用cfDNA分離方案處理大體積樣品在技術(shù)上更具挑戰(zhàn)性?；?/span>ucfDNA的分析的實(shí)施面臨的主要挑戰(zhàn)是分析性的，處理方法和收集時(shí)間的差異限制了這些方法的廣泛采用。

3、腦脊液ctDNA（CSF ctDNA）●

由于血腦屏障限制了ctDNA和CTCs的轉(zhuǎn)移，腦脊液成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤ctDNA的極好來(lái)源。此外，相對(duì)于血漿，腦脊液通常含有較少的循環(huán)免疫細(xì)胞，這可能會(huì)降低腦脊液的總cfDNA含量，從而允許更敏感地檢測(cè)低VAFs下存在的癌癥特異性突變。

腦脊液中ctDNA的相對(duì)豐度是中樞神經(jīng)系統(tǒng)患者中使用液體活檢取樣的關(guān)鍵考慮因素，也更能代表腫瘤負(fù)擔(dān)。一些已建立的腦脊液ctDNA分子標(biāo)記物包括1p/19q編碼缺失和IDH1/2、H3F3A、HIST1H3B/C、ATRX、RELA、TP53、TERT和BRAF的改變，成功地將膠質(zhì)瘤分型，并提供預(yù)后信息。同時(shí)，腦脊液ctDNA還與轉(zhuǎn)移狀態(tài)及無(wú)進(jìn)展生存率密切相關(guān)，也可用于監(jiān)測(cè)疾病復(fù)發(fā)的反應(yīng)和/或檢測(cè)，以及用于表征特異性耐藥機(jī)制。

為了更廣泛地使用基于CSF ctDNA的測(cè)定，需要進(jìn)一步考慮某些實(shí)用元素。由于腰椎穿刺的侵入性，獲取用于轉(zhuǎn)化研究的樣本（在沒(méi)有腦積水等治療指征的情況下）可能具有倫理挑戰(zhàn)性。用于腦脊液分析的基于ctDNA的分析的其他限制因素包括樣本量小、因排除腰椎穿刺禁忌癥患者而產(chǎn)生的偏差以及技術(shù)問(wèn)題，如腰穿過(guò)程中血液污染以及樣本處理時(shí)間的變化等。

4、胸膜和腹膜液ctDNA●

胸膜和腹膜液是血液的超濾液，由于缺乏外周血細(xì)胞，相對(duì)富含非造血cfDNA。惡性胸腔積液（MPE）和腹水可包含浸潤(rùn)胸膜和/或腹膜的腫瘤細(xì)胞，液體非常接近腫瘤組織，可能含有來(lái)自腫瘤細(xì)胞的ctDNA。

MPE具有較高的cfDNA含量，比組織和血漿樣本更易于進(jìn)行基因組分析。分析胸膜ctDNA的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，樣本（通過(guò)胸腔積液獲得）可立即用于基因檢測(cè)，而組織樣本通常需要按照標(biāo)準(zhǔn)的護(hù)理診斷流程進(jìn)行常規(guī)組織病理學(xué)處理。此外，在胸膜液ctDNA中通?？蓹z測(cè)到相比血漿樣品中更多的驅(qū)動(dòng)因素改變和可操作的變異。

關(guān)于樣本采集可行性的類(lèi)似考慮適用于胸膜或腹膜液抽吸：胸膜和/或腹膜抽吸術(shù)是一種中等侵入性手術(shù)，需要訓(xùn)練有素的操作員。對(duì)于不明原因的積液/腹水或者疾病復(fù)發(fā)或進(jìn)展時(shí)，出于診斷或治療目的進(jìn)行抽吸是標(biāo)準(zhǔn)方法；然而，預(yù)先計(jì)劃的重復(fù)采樣以監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)可能不太實(shí)際。

5、唾液ctDNA（sctDNA）●

唾液無(wú)需衛(wèi)生保健專(zhuān)業(yè)人員在場(chǎng)即可非侵入性獲取。唾液ctDNA（sctDNA）可被檢測(cè)局部腫瘤如頭頸癌的狀態(tài)。此外，sctDNA還可能通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散、主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)或通過(guò)粘膜超濾血液中的ctDNA，而起源于更遠(yuǎn)端的惡性腫瘤。

sctDNA的分析受到若干技術(shù)挑戰(zhàn)的限制。在非小細(xì)胞肺癌患者中，基于dPCR的血漿和唾液樣本中EGFR突變分析顯示了高度一致性，盡管部分患者在血漿中有可檢測(cè)到EGFR變化但唾液DNA樣本中未檢測(cè)到EGFR變化。這一觀(guān)察可能是因?yàn)閺难獫{進(jìn)入唾液的ctDNA濃度低。其他研究表明，sctDNA片段超短（40–60 bp），并且使用常規(guī)PCR技術(shù)可能無(wú)法擴(kuò)增；這一觀(guān)察導(dǎo)致了電場(chǎng)誘導(dǎo)釋放和測(cè)量（EFIRM）試驗(yàn)的發(fā)展，以檢測(cè)唾液中的EGFR改變。直接比較表明，EFIRM是比dPCR更敏感的檢測(cè)方法，因此可能是評(píng)估HNSCC以外的惡性腫瘤患者唾液樣本的佳方法。

6、糞便ctDNA●

人類(lèi)DNA通過(guò)細(xì)胞脫落和結(jié)腸細(xì)胞凋亡的組合進(jìn)入糞便。然而，人類(lèi)DNA僅占糞便總DNA含量的0.01%左右，其余來(lái)自胃腸道和/或飲食中的細(xì)菌。

CRC篩查是目前糞便DNA作用研究的一個(gè)重要焦點(diǎn)。使用測(cè)序Panel對(duì)糞便DNA樣本進(jìn)行分析表明，與糞便免疫化學(xué)和潛血檢測(cè)相比，CRC檢測(cè)的敏感性增加，盡管假陽(yáng)性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)增加。除篩查外，基于NGS的糞便DNA樣本分析已成功檢測(cè)出胃腸道癌癥患者樣本中已確定的癌癥相關(guān)基因的一系列熱點(diǎn)突變，從而突出了糞便DNA分析在醫(yī)學(xué)和預(yù)測(cè)中的作用。糞便DNA的分析也可能具有超出腫瘤DNA檢測(cè)的效用：對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者糞便樣品中16S核糖體DNA的分析表明，微生物組的組成可能與免疫檢查點(diǎn)抑制劑患者的反應(yīng)性和毒性相關(guān)，并可作為預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物。

總之，糞便DNA有可能通過(guò)作為癌癥篩查計(jì)劃一部分的分析來(lái)改善結(jié)果，并提供關(guān)于單個(gè)腫瘤基因組特征的信息，從而為精確醫(yī)學(xué)方法提供信息。當(dāng)前的挑戰(zhàn)包括糞便中可檢測(cè)到的腫瘤DNA的稀少、對(duì)糞便微生物組的了解不足。依從性是一個(gè)限制，幾項(xiàng)研究表明，參與者厭惡基于糞便的采樣，這可能會(huì)阻礙此類(lèi)方法的采用。

7、精液ctDNA（cfsDNA）●

精液來(lái)源于精囊，可用于獲取ctDNA進(jìn)行分析。無(wú)細(xì)胞精液DNA（cfsDNA）通常以高于其他體液中cfDNA的濃度存在；cfsDNA的相對(duì)豐度可能是由于提供樣品前的性禁欲（3-5天）（允許分泌的DNA積累）和由于其他精液成分的影響而降低的DNA酶活性。前列腺癌患者與非前列腺癌患者的cfsDNA比較表明，前者的中位濃度明顯較高（428.45 ng/ml與25.4 ng/ml）。鑒于前列腺癌患者（如涉及NGS的患者）的csfDNA在該液體中的高濃度可用，尤其是因?yàn)樵撘后w也可以非侵入性獲得，因此有必要對(duì)其進(jìn)行更全面的分析。

目前，基于cfsDNA的檢測(cè)的臨床應(yīng)用的局限性包括缺乏用于樣品收集和分析的明確方案；這些問(wèn)題需要在廣泛采用之前得到解決。此外，從雄激素缺乏后勃起功能障礙或放射治療后精液量減少的患者身上獲取精液樣本可能會(huì)出現(xiàn)困難。在接受性前列腺切除術(shù)并切除精囊的患者中的效用也不可得。

8、cfDNA的新興來(lái)源●

除了已經(jīng)討論過(guò)的流體，還有其他幾種可能的cfDNA來(lái)源。已在膽道癌患者的膽汁中鑒定出cfDNA，在檢測(cè)癌癥相關(guān)體細(xì)胞突變方面優(yōu)于血漿ctDNA。在107名絕經(jīng)后出血后接受宮腔鏡檢查和刮宮術(shù)的女性隊(duì)列中，研究了子宮灌洗液作為cfDNA的來(lái)源。在隨后被診斷為子宮內(nèi)膜惡性腫瘤的所有7名女性中，都發(fā)現(xiàn)了癌癥相關(guān)基因的突變。類(lèi)似地，從子宮內(nèi)膜癌婦女的衛(wèi)生棉條采集的陰道液樣本中可以檢測(cè)到典型與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的高甲基化模式。這些例子突出了涉及ctDNA技術(shù)應(yīng)用的新方法的潛在范圍，這些技術(shù)已經(jīng)用于分析血漿ctDNA到其他體液中。

9、挑戰(zhàn)和機(jī)遇●

在將非血液ctDNA分析轉(zhuǎn)化為臨床的嘗試中，必須克服幾個(gè)挑戰(zhàn)。

1. ctDNA的半衰期相對(duì)較短（約2 h）需要快速處理，這對(duì)使用更具侵入性的程序獲得的樣品提出了挑戰(zhàn)，并且仍然需要簡(jiǎn)化從采集到處理的采樣過(guò)程。含有防腐劑的穩(wěn)定管可用，可將血漿樣品中ctDNA的處理時(shí)間延長(zhǎng)至48小時(shí)?然而，這些防腐劑對(duì)非血液來(lái)源的ctDNA的影響尚未確定。

2. 其他一些與運(yùn)輸和儲(chǔ)存條件有關(guān)的分析前變量也沒(méi)有得到解決，這些變量對(duì)于非血液來(lái)源的樣品來(lái)說(shuō)可能更難標(biāo)準(zhǔn)化。

3. 將侵入性取樣程序（如胸膜抽吸和腰椎穿刺）納入臨床試驗(yàn)方案可能也很難證明其合理性。相反，尿液和唾液樣本可以完全非侵入性地獲得，并在許多時(shí)間點(diǎn)重復(fù)，對(duì)患者的風(fēng)險(xiǎn)小。

4. 目前缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的分析方法限制了非血液ctDNA在特定研究目的和/或臨床試驗(yàn)中的使用。需要在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證，其中非血液ctDNA檢測(cè)用于確定治療資格、時(shí)間或治療選擇。

非血液來(lái)源的ctDNA，其敏感性水平與血漿ctDNA的敏感性水平相當(dāng)。然而，從多種生物流體中收集ctDNA可能是互補(bǔ)的，與單獨(dú)分析血漿ctDNA相比，可以用于提高總體敏感性，并提供對(duì)不同解剖部位和時(shí)間的腫瘤特征的更深入了解。血漿ctDNA檢測(cè)早期惡性腫瘤（篩查計(jì)劃的目標(biāo)）的敏感性可能低于晚期疾病，這突出表明，使用更接近原發(fā)腫瘤的生物流體進(jìn)行檢測(cè)可能是有利的。

10、結(jié)論

從非血液體液中獲得的ctDNA分析具有幾個(gè)潛在的益處，從探索性研究到常規(guī)臨床應(yīng)用，例如能夠更詳細(xì)地分析特定解剖位置的特定腫瘤類(lèi)型，以及完全無(wú)創(chuàng)性連續(xù)采樣的可能性。然而，在臨床上廣泛實(shí)施非血液ctDNA檢測(cè)之前，必須進(jìn)行精心設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)，將結(jié)果用于指導(dǎo)治療決策并證明對(duì)患者有意義的益處。