通過分離菌的胞外代謝組學(xué)推斷生物結(jié)皮中微生物與代謝物關(guān)系

研究背景

本篇文章的研究對(duì)象是生物結(jié)皮（biocrusts），這是一種在干旱半干旱區(qū)中重要的地表覆蓋類型，是由細(xì)菌、真菌、藻類等隱花植物及其菌絲、分泌物等與土壤砂礫粘結(jié)形成的復(fù)合物，與其他土壤一樣，生物結(jié)皮中也存在有機(jī)質(zhì)（SOM），其在保持土壤濕度、增加微生物多樣性方面起著重要的作用，代謝組學(xué)蛋白組學(xué)文獻(xiàn)分享，同樣，微生物群落多樣性和豐富度與不同生態(tài)系統(tǒng)中的土壤（包括極地土壤，農(nóng)業(yè)土壤和干旱土壤）有機(jī)物也呈現(xiàn)出正相關(guān)的關(guān)系。

現(xiàn)在一般認(rèn)為由土壤微生物循環(huán)的有機(jī)物質(zhì)是微生物代謝物的復(fù)雜混合物，可以通過土壤代謝組學(xué)詳細(xì)的描述其特征，并可由此推知微生物與代謝物的關(guān)系。

代謝組學(xué)蛋白組學(xué)文獻(xiàn)分享，本研究中，作者對(duì)生物結(jié)皮中不同潤(rùn)濕時(shí)間和不同演替階段中代謝物及微生物的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了分析，并且通過生物結(jié)皮中分離培養(yǎng)菌體與其代謝的胞外代謝物關(guān)系（釋放和消耗）來預(yù)測(cè)活性生物結(jié)皮中與其親緣關(guān)系密切的微生物與相應(yīng)代謝物的關(guān)系。

研究方法

1.分組設(shè)置：

實(shí)驗(yàn)組：4個(gè)生物結(jié)皮演替階段（A-D，如圖1），5個(gè)潤(rùn)濕時(shí)間，每組5個(gè)重復(fù)，共100個(gè)樣本。

對(duì)照組1：無菌超純水（3個(gè)重復(fù)），可扣除背景噪音。

對(duì)照組2：高溫滅菌4次的生物結(jié)皮（D階段，5個(gè)潤(rùn)濕時(shí)間點(diǎn)，3個(gè)重復(fù)），為了排除非生物因素（如光解、吸附作用等）導(dǎo)致的代謝差異而設(shè)置。

2.研究方法：

代謝組學(xué)（5個(gè)生物學(xué)重復(fù)）、宏基因組學(xué)（1個(gè)生物學(xué)重復(fù)）、轉(zhuǎn)錄組學(xué)（其他學(xué)者的數(shù)據(jù)）

3.檢測(cè)平臺(tái)：

實(shí)驗(yàn)組：正模式: Q-TOF； 負(fù)模式: QE ；      

對(duì)照組2：（正負(fù)模式）QE

宏基因組： Illumina HiSeq 4000

4. 數(shù)據(jù)分析：

Matlab R2016A: 多因素方差分析和多重比對(duì)分析 ；R: Spearman’s 相關(guān)性分析、the exact binomial test；KEGG pathways。

5. 實(shí)驗(yàn)流程：

需要說明的是，黃色標(biāo)記的Exome[x]tabolomics是本文作者同一實(shí)驗(yàn)室工作人員在2016年發(fā)在Nature Communications上的研究結(jié)果，在這里做一下簡(jiǎn)單描述，方便后面對(duì)本篇文章的理解。

2016年的文章要點(diǎn)：

（1）從生物結(jié)皮（與本研究為同一位置取樣）中分離培養(yǎng)了7種菌（1種鞘藻屬菌的光合自養(yǎng)型菌和6種異養(yǎng)型菌）。

（2）經(jīng)過對(duì)生物結(jié)皮中豐度較大的鞘藻屬菌體的細(xì)胞提取物代謝譜與其消耗的基本培養(yǎng)基代謝譜的比較發(fā)現(xiàn)，該菌細(xì)胞中的物質(zhì)絕大多數(shù)被釋放到培養(yǎng)基中（對(duì)生物結(jié)皮則是被釋放在土壤中）（如圖3，綠色為細(xì)胞提取物，藍(lán)色為被消耗的基本培養(yǎng)基中代謝物），因此可以以該細(xì)胞提取物來模擬生物結(jié)皮環(huán)境。

（3）分別在基本培養(yǎng)基中添加上述鞘藻屬菌體的細(xì)胞提取物和6種異養(yǎng)型菌的細(xì)胞提取物以模擬生物結(jié)皮環(huán)境，然后分別培養(yǎng)6種異養(yǎng)型菌，代謝組學(xué)蛋白組學(xué)文獻(xiàn)分享，比較空培養(yǎng)基代謝譜和被菌體消耗后的培養(yǎng)基代謝譜，物質(zhì)含量降低則視為被菌體消耗，含量升高則視為由菌體產(chǎn)生，從而確定這6種菌與相應(yīng)代謝物的關(guān)系。

3研究結(jié)果

1.代謝物隨潤(rùn)濕時(shí)間和演替階段呈現(xiàn)出規(guī)律性變化，且潤(rùn)濕時(shí)間對(duì)代謝物變化的影響大于演替階段。

通過對(duì)不同潤(rùn)濕時(shí)間和演替階段下物質(zhì)的聚類發(fā)現(xiàn)，物質(zhì)主要聚集成3類Cluster1、2、3。

Cluster1：主要是脂肪酸，在不同演替階段的早期含量多，且隨時(shí)間變長(zhǎng)而減少；

Cluster2：主要是極性氨基酸及核苷酸堿基，在3min-18h含量較多，且隨后含量降低；

Cluster3：在比較晚的時(shí)間點(diǎn)及較成熟的生物結(jié)皮中累計(jì)較多。

為了比較潤(rùn)濕時(shí)間和演替階段兩因素對(duì)代謝物變化影響的強(qiáng)弱，根據(jù)物質(zhì)的峰面積做了主成分分析，可以發(fā)現(xiàn)潤(rùn)濕時(shí)間在第一主成分方向區(qū)分的更明顯，不同演替階段在第二主成分方向較明顯，因此說明潤(rùn)濕時(shí)間對(duì)代謝物變化影響更大。

2. 由于生物活性造成的不同演替階段代謝物的動(dòng)態(tài)變化

為了探討這些物質(zhì)的變化哪些是由生物活性引起的，作者將不同演替階段及潤(rùn)濕時(shí)間物質(zhì)變化情況與高溫滅菌對(duì)照組做了比較，發(fā)現(xiàn)有53個(gè)物質(zhì)在至少一個(gè)階段是與高溫滅菌對(duì)照組有差異標(biāo)“*”的物質(zhì)），其他物質(zhì)則是由非生物因素造成。

3.宏基因組推斷微生物群落結(jié)構(gòu)及潤(rùn)濕時(shí)間和不同演替階段中群落結(jié)構(gòu)的變化情況

在對(duì)代謝物做了初步分析之后，作者又對(duì)樣本進(jìn)行了宏基因組測(cè)序，但是物種注釋的方法使用的是更穩(wěn)定可靠的核糖體蛋白基因來注釋的，而非16SrRNA基因測(cè)序。

與16SrRNA基因測(cè)序相比，核糖體蛋白基因有以下3個(gè)優(yōu)點(diǎn)：核糖體蛋白基因在幾乎所有基因組中都作為單拷貝存在；宏基因組數(shù)據(jù)集中組裝效果好（通常優(yōu)于16S rRNA基因）；保守性好并且產(chǎn)生了更高分辨率的系統(tǒng)發(fā)育樹。

作者從組裝的基因中共定性出17個(gè)核糖體蛋白基因，其中L15核糖體蛋白基因群落覆蓋范圍廣，達(dá)466個(gè)，因此選用該基因作為物質(zhì)注釋和豐度計(jì)算。代謝組學(xué)蛋白組學(xué)文獻(xiàn)分享，通過對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，藍(lán)細(xì)菌門在不同階段潤(rùn)濕早期（3min）和晚期（49.5h）豐度減少由3 min的17–28%到49.5h:1–3%；

而厚壁菌門則在不同階段潤(rùn)濕早期（3min）和晚期（49.5h）豐度增多，由3 min的4–5%到49.5h: 19–39%。其他菌門（如放線菌門、變形菌門）均無明顯變化，即受潤(rùn)濕作用影響較小。

4.組裝rplO基因與分離培養(yǎng)菌體rplO基因比較

為了根據(jù)前面提到的16年文章微生物與代謝物的關(guān)系推斷本研究生物結(jié)皮中微生物與代謝物的關(guān)系，作者將本研究中宏基因組組裝的rplO基因與16年文章中分離培養(yǎng)菌體的rplO基因做了序列相似性比較，保留了相似度超過86%的菌體，并且計(jì)算了平均核苷酸均一性（ANI），共有四種菌與先前分離培養(yǎng)的菌有較高的匹配度另外，這四種菌在整個(gè)微生物群落中占比也超過了30%，屬于優(yōu)勢(shì)菌種。

在比較16年代謝結(jié)果與本研究代謝結(jié)果后，發(fā)現(xiàn)有32個(gè)共有物質(zhì)，但有9個(gè)是由非生物因素引起，排除后剩余的23個(gè)物質(zhì)挑選出來，根據(jù)其峰面積與上述匹配的生物結(jié)皮中的四種菌進(jìn)行了相關(guān)性分析，并與16年得到的微生物與代謝物的關(guān)系（消耗或產(chǎn)生）進(jìn)行比較。

代謝組學(xué)蛋白組學(xué)文獻(xiàn)分享，按照預(yù)期，被消耗的代謝物與菌體豐度應(yīng)該成負(fù)相關(guān)，被生成的代謝物與菌體豐度成正相關(guān)，通過spearman相關(guān)性分析后找到了48種微生物-代謝物之間的關(guān)系，其中69%有跟預(yù)期相符的關(guān)系。

以食物網(wǎng)的形式展示該關(guān)系可見圖9，該圖中紅色實(shí)線表示該物質(zhì)被釋放，且微生物與代謝物的關(guān)系與16年文章結(jié)果一致，虛線則表示不一致；藍(lán)色實(shí)線表示該物質(zhì)被消耗，且微生物與代謝物的關(guān)系與16年文章結(jié)果一致，虛線則表示不一致。

代謝組學(xué)蛋白組學(xué)文獻(xiàn)分享，并且繪制了C階段三種菌的豐度隨潤(rùn)濕時(shí)間變化的曲線（下面的灰色曲線），可見潤(rùn)濕早期，Microcoleus sp.（鞘藻屬）豐度迅速升高，隨著潤(rùn)濕時(shí)間的推移，將胞內(nèi)物質(zhì)釋放到周圍環(huán)境中，此時(shí)芽孢桿菌Bacillus sp. 1（芽孢桿菌1）和Bacillus sp. 2（芽孢桿菌2）利用鞘藻屬菌體釋放的物質(zhì)豐度開始逐漸增多，而Microcoleus sp.（鞘藻屬）豐度則逐漸降低。

說明Microcoleus sp.是初級(jí)生產(chǎn)者，主要為其他異養(yǎng)微生物提供營(yíng)養(yǎng)。

5.轉(zhuǎn)錄組驗(yàn)證

后面作者又對(duì)上述結(jié)果做了簡(jiǎn)單的驗(yàn)證，作者通過對(duì)其他學(xué)者做的生物結(jié)皮（也與本研究取樣地點(diǎn)一致）的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)進(jìn)行了KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸合成途徑均增加，相同氨基酸的分解代謝基本不變或者稍微增加。

代謝組學(xué)蛋白組學(xué)文獻(xiàn)分享，這也與在代謝物聚類分析（圖1）中cluster2中主要是氨基酸類物質(zhì)，且在潤(rùn)濕早中期含量較豐富一致。

4結(jié)論

大多數(shù)土壤代謝物在潤(rùn)濕事件和生物結(jié)皮發(fā)展階段顯示出與四種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的預(yù)期關(guān)系（正相關(guān)或負(fù)相關(guān)）。

代謝組學(xué)蛋白組學(xué)文獻(xiàn)分享，研究結(jié)果表明，代謝物分析、宏基因組鳥槍測(cè)序和胞外代謝組學(xué)可以成功地整合到微生物群落結(jié)構(gòu)與代謝物組成的功能分析上，將土壤微生物與土壤化學(xué)組織聯(lián)系起來，以確定復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)中微生物的胞外代謝物網(wǎng)絡(luò)。