CAR-T細(xì)胞療法中如何克服T細(xì)胞耗竭？

近年來，以嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）為代表的免疫療法在癌癥治療方面取得了巨大的臨床進(jìn)步。然而， T細(xì)胞耗竭（T cell exhaustion）會(huì)嚴(yán)重影響癌癥免疫療法的治療效果，這制約著新型細(xì)胞療法的進(jìn)一步發(fā)展。 T細(xì)胞耗竭是一種功能減退的狀態(tài)，其特征在于T細(xì)胞效應(yīng)功能和自我更新能力的逐漸喪失。 

CAR-T細(xì)胞耗竭的證據(jù)

CAR-T細(xì)胞治療后的疾病復(fù)發(fā)仍然是現(xiàn)階段CAR-T免疫療法的一個(gè)主要挑戰(zhàn)，這促使學(xué)者們?nèi)ヌ剿?/span>CAR-T細(xì)胞耗竭在腫瘤逃逸中的潛在作用。與內(nèi)源性腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞相比，CAR-T細(xì)胞以其基因修飾為標(biāo)志，更有利于追蹤和評估腫瘤靶向細(xì)胞。此外，下一代CAR-T細(xì)胞療法可以進(jìn)一步對CAR-T細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，以減輕或中斷細(xì)胞耗竭。這些因素促使學(xué)者們?nèi)パ芯?/span>T細(xì)胞耗竭過程中的臨床相關(guān)背景和重要模型。 

臨床前體內(nèi)模型對于理解CAR-T細(xì)胞耗竭程序至關(guān)重要。在黑色素瘤的小鼠模型中，腫瘤浸潤性CAR-T細(xì)胞具有PD-1+TIM3high表型，與衰竭TOX和TOX2以及NR4A1、NR4A2和NR4A3的典型轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)增加相關(guān)。

同樣，慢性抗原誘導(dǎo)的信號和組成性的、低水平的、基礎(chǔ)的信號都會(huì)導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞耗竭。這些臨床前的發(fā)現(xiàn)表明CAR-T細(xì)胞具有耗竭特征的表型、轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳特征。 

臨床上，對治療中或復(fù)發(fā)后活檢樣本的分析將有助于確定CAR-T細(xì)胞耗竭導(dǎo)致患者疾病控制喪失的程度。有學(xué)者向B-ALL病人體內(nèi)輸注 CD19靶向、基于4-1BB的CAR-T細(xì)胞，在4周后獲取到了耗竭相關(guān)的DNA甲基化特征。另一項(xiàng)研究表明，輸注后幾個(gè)月，慢性淋巴細(xì)胞白血病患者的血液中持續(xù)存在TIM3+PD-1+ CAR-T細(xì)胞，這些細(xì)胞在臨床結(jié)果較差的患者中富集。盡管在這兩項(xiàng)研究中對循環(huán)耗竭的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行了全面的描述，但腫瘤微環(huán)境（TME）中 CAR-T細(xì)胞耗竭的數(shù)據(jù)相對缺乏，而TME通常是細(xì)胞耗竭突出的地方。 

在接受抗CD19 CAR-T細(xì)胞注射的51例大B細(xì)胞淋巴瘤（LBCL）患者的腫瘤免疫環(huán)境研究中，研究者報(bào)告了循環(huán)CAR-T細(xì)胞峰值水平 (對應(yīng)持久療效) 與TME中耗竭的CD8+ T細(xì)胞的豐度之間存在負(fù)相關(guān)。然而，該評估沒有區(qū)分耗盡的CD8+ T細(xì)胞是CAR-T細(xì)胞還是內(nèi)源性未修飾的T細(xì)胞。注入的CAR-T細(xì)胞缺乏持久性可能會(huì)限制對其耗竭的評估。 雖然表征輸注后CAR-T細(xì)胞的臨床報(bào)告數(shù)量較少，但關(guān)于生產(chǎn)后和輸注前體外CAR-T細(xì)胞表型的文獻(xiàn)相對較多。低分化細(xì)胞比例較高的產(chǎn)品，如CD45RA+CCR7+ CAR-T細(xì)胞，與多種血液惡性腫瘤的預(yù)后改善相關(guān)。

此外，具有較高水平抑制性受體 (如PD-1和LAG3) 的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)物在輸注后擴(kuò)增較少，并與慢性淋巴細(xì)胞白血病、兒童和年輕成人CD19+白血病或LBCL患者的較低應(yīng)答率相關(guān)。雖然T細(xì)胞在刺激后5-8天表現(xiàn)出耗竭的表觀遺傳特征，但共抑制受體也在高功能、活化的T細(xì)胞上表達(dá)。因此，這些預(yù)輸注數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了兩個(gè)要點(diǎn)：(1) 除耗竭之外的其他細(xì)胞狀態(tài)，包括效應(yīng)子和記憶分化，可以解釋T細(xì)胞的功能和持久性；(2) 僅基于共抑制受體的表達(dá)很難評估T細(xì)胞耗竭。

阻斷CAR-T細(xì)胞耗竭

輸注前和輸注后的CAR-T細(xì)胞表型與來自臨床前體內(nèi)模型的數(shù)據(jù)表明了CAR-T細(xì)胞耗竭在臨床結(jié)果上的限制作用。如果CAR-T細(xì)胞確實(shí)因耗竭而受損，那么中斷這種功能低下的細(xì)胞狀態(tài)就會(huì)提高疾病的治療效果。CAR-T細(xì)胞耗竭程序的中斷也許可以通過廢除典型的TOX和NR4A轉(zhuǎn)錄因子或抗體介導(dǎo)的共抑制受體如PD-1的阻斷來實(shí)現(xiàn)。 

不受控的NFAT信號導(dǎo)致耗竭相關(guān)T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NR4A和TOX的表達(dá)，從而加強(qiáng)了與耗竭相關(guān)的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄程序。刪除Nr4a1、Nr4a2和Nr4a3基因后則可以恢復(fù)功能和表觀遺傳程序，增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞在實(shí)體瘤小鼠中的功效。類似地，具有短發(fā)夾RNA介導(dǎo)的Tox敲除的小鼠，其CAR-T細(xì)胞比Tox野生型細(xì)胞更持久且具有更強(qiáng)的治療活性，特別是當(dāng)Tox2基因缺陷時(shí)。有趣的是，其他研究表明，在患有腫瘤或慢性病毒感染小鼠中，Tox基因的缺失會(huì)導(dǎo)致凋亡增加和抗原特異性鼠T細(xì)胞的持久性受損。這種差異可以用Tox基因完全缺失的差異作用來解釋，而shRNA介導(dǎo)的敲低則是使表達(dá)部分減少，而非完全缺失。

然而，綜合這些結(jié)果，學(xué)者們擔(dān)心T細(xì)胞內(nèi)耗竭途徑的分子中斷可能會(huì)損害T細(xì)胞的適應(yīng)性。 許多臨床前研究和至少20個(gè)有效的臨床試驗(yàn)都致力于通過阻斷或消除PD-1信號傳遞以增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞功能。他們通過多種方式實(shí)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞中PD-1的功能性消除。其中直接的方法就是用抗PD-L1抗體對患者進(jìn)行聯(lián)合治療。在CD19靶向的CAR-T細(xì)胞治療后疾病復(fù)發(fā)的患者中，用這種抗體治療會(huì)導(dǎo)致病人外周血中CAR-T細(xì)胞的重新擴(kuò)增；然而臨床上的療效反應(yīng)則很少，在12名患者中僅有1例完全緩解和3例部分緩解。在28名患者參與的一項(xiàng)更大規(guī)模的臨床研究中，抗CD19 CAR-T細(xì)胞和早期PD-L1阻斷被聯(lián)合使用，來治療大B細(xì)胞淋巴瘤患者。

臨床結(jié)果顯示，持久的應(yīng)答率與單獨(dú)使用CAR-T細(xì)胞治療的結(jié)果相似，這表明聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療沒有額外的益處。 一項(xiàng)來自一期試驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，在18例惡性胸膜間皮瘤患者中，靶向間皮素的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品和抗PD-1抗體的組合具有良好的療效 (中位和1年總生存期分別為23.9個(gè)月和83個(gè)月)；然而，有一部分間皮瘤患者也會(huì)對單獨(dú)的抗PD-1治療產(chǎn)生反應(yīng)。 

上述研究表明對PD-1信號的阻斷不足以從表觀遺傳學(xué)上重新逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞耗竭程序，而只能部分逆轉(zhuǎn)耗竭的轉(zhuǎn)錄表型。因此，在CAR-T細(xì)胞輸注后，共抑制性受體阻斷發(fā)生在早期 (當(dāng)它能阻斷低分化效應(yīng)子中的抑制信號時(shí)) 還是晚期 (耗竭發(fā)作后) 更有效尚不清楚。CAR-T細(xì)胞是否會(huì)形成前體耗竭狀態(tài)仍然有待研究。 在抑制PD-1或其他共抑制受體信號傳導(dǎo)的其他方法中，有一種方法是改造CAR-T細(xì)胞本身以分泌拮抗抗體。此外，PD-1顯性失活受體 (DNRs) 的過表達(dá)或者對CAR-T細(xì)胞中PDCD1基因座進(jìn)行基因編輯可以從本質(zhì)上消除PD-1信號傳導(dǎo)。每種方法都有潛在的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。

例如，CAR-T細(xì)胞原位分泌抗PD-1抗體可能會(huì)限制全身性抗體暴露，從而降低毒性。T細(xì)胞內(nèi)的基因編輯方法則可以有效地消除編輯細(xì)胞中的信號傳導(dǎo)，但不會(huì)增強(qiáng)內(nèi)源性T細(xì)胞回應(yīng)。缺乏細(xì)胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域的PD-1 DNR的過表達(dá)可以通過與內(nèi)源性PD-1競爭與微環(huán)境PD-L1的結(jié)合來減輕修飾T細(xì)胞中的抑制性信號傳導(dǎo)。這些方法都被證明可以增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞在各種血液和實(shí)體腫瘤中的臨床前抗腫瘤功效。 

目前正在進(jìn)行的，將PD-1阻斷納入CAR-T細(xì)胞治療的大量臨床試驗(yàn)將會(huì)產(chǎn)生更明確的結(jié)論。此外，在針對接受CRISPR-Cas9工程改造T細(xì)胞治療的三名患者的早期研究中也產(chǎn)生了激動(dòng)人心的結(jié)果。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，在這些患者中，帶有PD-1缺失的T細(xì)胞的持久性低于PD-1未缺失的T細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)可能有與PD-1生物學(xué)無關(guān)的其他解釋，如多重編輯的遺傳毒性應(yīng)激；然而，它與在小鼠研究中的觀察結(jié)果相一致，在小鼠研究中，PDCD 1缺乏和抑制性PD-1信號的喪失導(dǎo)致對慢性病毒感染有反應(yīng)的抗原特異性CD8+ T細(xì)胞的過度刺激，引起細(xì)胞死亡。因此，效應(yīng)期共抑制受體的表達(dá)可能有助于抑制T細(xì)胞過度刺激，未來學(xué)者們需要進(jìn)一步通過研究來闡明能保留T細(xì)胞持久性和功能性，同時(shí)又能將PD-1 消除的佳方法和時(shí)機(jī)。 

大量研究表明T細(xì)胞的耗竭是表觀遺傳固定的，并且普遍認(rèn)為這些耗竭的后期階段不太容易接受治療干預(yù)，因此，針對T細(xì)胞分化途徑的早期階段的干預(yù)可能是提高抗腫瘤免疫的有效方法。改善細(xì)胞培養(yǎng)條件和優(yōu)化CAR設(shè)計(jì)及下游信號傳導(dǎo)的策略，提供了緩解 （而非阻斷） 誘導(dǎo)T細(xì)胞耗竭程序的可能性，從而增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞功能。

提高CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的比率

耗竭并不是純粹的T細(xì)胞內(nèi)在過程，還可能取決于腫瘤和患者的特征。腫瘤微環(huán)境 (TME) 中的代謝和基質(zhì)因子可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞耗竭。另外，癌細(xì)胞的特征可以決定CAR-T細(xì)胞療法的療效。例如，白血病細(xì)胞中的死亡受體信號傳導(dǎo)受損可以誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞耗竭。此外，已經(jīng)有學(xué)者注意到CAR-T細(xì)胞活性的疾病特異性差異。例如，與血液惡性腫瘤相比，CAR-T細(xì)胞對實(shí)體瘤的細(xì)胞毒性依賴于IFN受體信號傳導(dǎo)。 除了癌細(xì)胞的定性特征外，其定量特征也可能決定CAR-T細(xì)胞療法的療效。

CAR-T細(xì)胞治療的臨床獲益與多種疾病的腫瘤負(fù)荷呈負(fù)相關(guān)，包括急性淋巴性白血病 （ALL） 和大B細(xì)胞淋巴瘤 （LBCL） 。這一發(fā)現(xiàn)的一個(gè)潛在解釋是較高的抗原負(fù)荷導(dǎo)致持續(xù)的CAR刺激，從而導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞耗竭，這進(jìn)一步論證了在CAR-T細(xì)胞治療前減少癌細(xì)胞數(shù)量作為限制CAR-T細(xì)胞耗竭手段的可能性。這種策略可以以手術(shù)、放療、靶向治療或化療的形式出現(xiàn)。 另一方面，可以考慮增加注入的CAR-T細(xì)胞的數(shù)量。

一項(xiàng)涉及LBCL患者的臨床研究顯示，輸入病人體內(nèi)的CD8+ CAR-T細(xì)胞數(shù)量與持久應(yīng)答概率之間存在相關(guān)性。此外，輸注的CD8+ CAR-T細(xì)胞數(shù)量與治療前腫瘤負(fù)荷之比與持久應(yīng)答具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。 一項(xiàng)針對輸注CAR-T細(xì)胞的兒童患者的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，隨著組織細(xì)胞藥物劑量的增加，患者的無事件生存率、無復(fù)發(fā)生存率和總生存率均有所增加。

然而，考慮到既往治療史和疾病狀態(tài)可能是CAR-T細(xì)胞產(chǎn)量的混雜因素，學(xué)者們需要在前瞻性臨床試驗(yàn)中解決更高的CAR-T細(xì)胞劑量是否有益的問題。 此外，使用CAR靶向抗原進(jìn)行疫苗接種是目前在研的另一種可能增加體內(nèi)CAR-T細(xì)胞數(shù)量的方法。除CAR-T細(xì)胞外，內(nèi)源性T細(xì)胞應(yīng)答也可能有助于提高抗腫瘤活性?？傊?，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)表明，增加效應(yīng)T細(xì)胞與腫瘤負(fù)荷之比的策略是減輕T細(xì)胞耗竭和改善臨床結(jié)果的有希望的途徑。

優(yōu)化T細(xì)胞培養(yǎng)條件

臨床級CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的制造需要有優(yōu)化的收集步驟和標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序。大量的臨床前研究工作致力于改進(jìn)CAR-T產(chǎn)品的制造過程，并減少CAR-T細(xì)胞耗竭。 在小鼠B-ALL異種移植模型中，僅培養(yǎng)3天而不是9天 （現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為7-14天） 的CAR-T細(xì)胞即使以低六倍的劑量進(jìn)行輸注，仍能在小鼠體內(nèi)顯示出更大的擴(kuò)張性、作用持久性以及更強(qiáng)大的腫瘤控制能力。數(shù)據(jù)顯示，9天的CAR-T細(xì)胞分化程度較高，反而限制了它們自身的增殖能力和效應(yīng)功能。學(xué)者推測，培養(yǎng)9天的CAR-T細(xì)胞被更多地消耗，這表明較短的培養(yǎng)時(shí)間可能會(huì)緩解T細(xì)胞耗竭。 改變培養(yǎng)物中的細(xì)胞因子組成也可能會(huì)緩解T細(xì)胞耗竭。

與標(biāo)準(zhǔn)的IL-2補(bǔ)充相比，在IL-15存在的情況下培養(yǎng)的CAR-T細(xì)胞減少了細(xì)胞耗竭標(biāo)志物的表達(dá)，增強(qiáng)了抗凋亡特性，并增加了增殖能力。此外，在CAR-T細(xì)胞制造過程中，PI3K-AKT信號通路的抑制與在小鼠模型中CAR-T細(xì)胞更大的擴(kuò)張性、持久性和抗腫瘤活性有關(guān)。從機(jī)制上講，使用雙重PI3Kδ/γ抑制劑會(huì)導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞耗竭標(biāo)志物TIM3