一種應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體診斷的28重QF-PCR新方法

目的
建立一種檢測(cè)胎兒染色體非整倍體的28重QF-PCR新方法，評(píng)估該方法的臨床適用性。

方法
選取13號(hào)染色體上6個(gè)位點(diǎn)，18號(hào)染色體上6個(gè)位點(diǎn)，21號(hào)染色體上7個(gè)位點(diǎn)，X染色體上3個(gè)位點(diǎn)，Y染色體上1個(gè)位點(diǎn)和SRY，X和Y染色體共有2個(gè)位點(diǎn)和AMEL，位于3號(hào)染色體與X染色體的TAF9b共28個(gè)基因座，設(shè)計(jì)引物建立一管28重QF-PCR新方法。收集316例健康人群外周血樣本對(duì)該方法進(jìn)行雜合度和適用性評(píng)估。收集456例經(jīng)核型分析的臨床羊水樣本進(jìn)行該方法驗(yàn)證，分析總符合率、特異性和敏感性。

結(jié)論
本研究開(kāi)發(fā)的一管28重QF-PCR新方法是一種能夠準(zhǔn)確檢出胎兒染色體非整倍體的非常有效鑒定方法。

出生缺陷是一種先天性形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能或代謝異常所致的疾病。據(jù)報(bào)道，每200個(gè)新生兒中就有1個(gè)發(fā)生出生缺陷[1]。其中在產(chǎn)前檢測(cè)到的染色體異常中染色體21/18/13/X/Y異常占比>80%[2]。迄今為止，只能通過(guò)產(chǎn)前篩查或診斷的方式來(lái)減少或避免出生缺陷。

產(chǎn)前胎兒染色體非整倍體檢測(cè)主要通過(guò)核型分析或其他分子學(xué)方法進(jìn)行。核型分析作為染色體分析的金標(biāo)準(zhǔn)，需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。QF-PCR方法已被證明是一種非常有效的鑒定方法[3]。根據(jù)2016年發(fā)布的《QF-PCR技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識(shí)》[4]，通過(guò)QF-PCR技術(shù)可以診斷出99.2%~100.0%的21、18、13、X和Y等染色體非整倍體異常，還可以檢出三倍體和母源污染。具有經(jīng)濟(jì)、快速得出結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，更適合于臨床檢測(cè)的推廣應(yīng)用。

目前市場(chǎng)上基于QF-PCR技術(shù)檢測(cè)該5種染色體異常并通過(guò)NMPA批準(zhǔn)的商品化試劑盒只有達(dá)瑞生物的“染色體（13/18/21/X/Y）多重STR基因分型試劑盒（熒光PCR毛細(xì)管電泳法）”。該試劑盒選用20個(gè)STR位點(diǎn)對(duì)該5種染色體非整倍體進(jìn)行判斷，但仍有部分樣本因無(wú)法有效判讀。另外，該試劑盒在PCR階段分3管進(jìn)行，既導(dǎo)致成本增加也耗時(shí)耗力。因此本研究將開(kāi)發(fā)出一種一管多重QF-PCR新方法檢測(cè)胎兒染色體非整倍體，彌補(bǔ)原產(chǎn)品的不足，為臨床提供參考依據(jù)。

01、對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

（1）316例健康人群外周血樣本于2019年7月至2020年6月從達(dá)瑞醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)(廣州)有限公司收集。

（2）456例16~22周的孕婦羊水樣本于2020年9月至2021年5月從東莞市婦幼保健院和廣州婦女兒童醫(yī)院收集。

1.2  主要儀器與試劑

干式恒溫器；2720 PCR擴(kuò)增儀；3500Dx基因分析儀；NANODROP 2000；核酸提取或純化試劑盒和染色體（13/18/21/X/Y）多重STR基因分型試劑盒（熒光PCR毛細(xì)管電泳法）（廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司）（注：20重QF-PCR法）；10×PCR Buffer；TaKaRa Taq HS；dNTP；引物合成；GeneScanTM 600 LIZ® Size standard v2.0；ABI Hi-Di? formamide等。

1.3 方法

1.3.1  染色體核型分析

按細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)進(jìn)行培養(yǎng)和制片。

1.3.2  熒光定量PCR技術(shù)( QF-PCR）

（1）DNA 提取

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提羊水和外周血基因組DNA。

（2）引物設(shè)計(jì)

28個(gè)位點(diǎn)引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

（3）PCR反應(yīng)體系及條件

總體積25 μL，其中DNA 20~80 ng， dNTP 0.4 μL，10×PCR Buffer（Mg2+plus）3.5 μL，引物各100 pmol，TaKaRa Taq HS 1 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃ 延伸50 s，共25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

（4）毛細(xì)管電泳和片段分析

取1 μL PCR產(chǎn)物和13.5 μL甲酰胺、0.5 μL GeneScanTM 600 LIZ® Size standard v2.0（內(nèi)標(biāo)）混合。95℃變性5 min，在ABI 3500 Dx 基因分析儀和Gene mapper 4.1進(jìn)行片段分析。

1.3.3統(tǒng)計(jì)分析

1.3.3.1 健康人群的雜合度計(jì)算

單個(gè)STR位點(diǎn)雜合度計(jì)算

K代表單個(gè)STR位點(diǎn)雜合度；R代表單個(gè)STR位點(diǎn)出現(xiàn)雙峰或三峰的樣本數(shù)；Z代表總樣本數(shù)；

1.3.3.2 STR位點(diǎn)組合模式的適用性評(píng)估

（1）對(duì)13三體、18三體、21三體、XXX染色體型別判讀標(biāo)準(zhǔn)為相對(duì)應(yīng)的染色體上至少2個(gè)STR位點(diǎn)出現(xiàn)三峰或雙峰比值符合1:2或2:1的情況可判別相應(yīng)染色體為三體型別，因此STR位點(diǎn)組合模式對(duì)13三體、18三體、21三體、

（2）對(duì)XXY染色體型別判讀則為確定含Y染色體的情況下，至少1個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)雙峰且比值符合1:1的情況，因此STR位點(diǎn)組合模式對(duì)XXY染色體非整倍體

P代表適用性，代表第個(gè)STR位點(diǎn)；代表每條染色體的STR位點(diǎn)總數(shù)；N代表第個(gè)STR位點(diǎn)雜合度；

代表第個(gè)STR位點(diǎn)的純合概率。

1.3.3.3 臨床羊水樣本的總符合率、靈敏度和特異度計(jì)算

根據(jù)表2，計(jì)算28重QF-OCR新方法的結(jié)果和染色體核型分析結(jié)果對(duì)比的總符合率、靈敏度和特異度。

表2 臨床羊水樣本結(jié)果的統(tǒng)計(jì)方法

具體計(jì)算公式如下：

02、結(jié)果

2.1 28重QF-PCR新方法與原試劑盒的位點(diǎn)信息對(duì)比

在原試劑盒20重QF-PCR法的基礎(chǔ)上，28重QF-PCR新方法分別在13號(hào)染色體增加了D13S317、D13S325，18號(hào)染色體上增加了D18S390、D18S978、D18S499；21號(hào)染色體增加了D21S1437、D21S1435、D21S11；X染色體上增加了HPRTB，Y染色體上增加了DYS448，還增加了X和Y染色體共有的DXYS218、DXYS267及3號(hào)染色體和X染色體共有的TAF9b位點(diǎn)，具體見(jiàn)表3。

2.2 STR位點(diǎn)雜合度和檢測(cè)的適用性評(píng)估

13號(hào)染色體6個(gè)位點(diǎn)的雜合度分布范圍為0.70~0.87；18號(hào)染色體7個(gè)位點(diǎn)雜合度分布范圍0.57~0.86；21號(hào)染色體9個(gè)位點(diǎn)的雜合度分布范圍0.63~0.86；X染色體上7個(gè)位點(diǎn)的雜合度分布范圍0.56~0.88，具體見(jiàn)表3。

計(jì)算28重QF-PCR新方法在檢測(cè)13三體、18三體、21三體、XXX、XXY的適用性P值分別為99.9%、99.3%、99.9%、96.0%、99.7%；而原試劑盒20重QF-PCR法的適用性則為97.4%、95.2%、99.8%、96.4%、99.8%。因納入統(tǒng)計(jì)的男性樣本較少，本研究未對(duì)Y染色體位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.3 臨床羊水樣本的陽(yáng)性符合率和靈敏度，陰性符合率和特異度分析

根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）計(jì)算，28重QF-PCR新方法與染色體核型分析結(jié)果相比，總符合率、靈敏度和特異度。

4、28重QF-PCR新方法檢測(cè)結(jié)果與染色體核型結(jié)果樣本數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.4 原試劑盒未檢出的臨床樣本適用性評(píng)估

對(duì)原試劑盒20重QF-PCR方法檢測(cè)無(wú)法判斷的14例羊水樣本，其中1例13三體陽(yáng)性，1例18三體陽(yáng)性，12例正常樣本，28重QF-PCR新方法均能夠檢出，結(jié)果與核型分析檢測(cè)結(jié)果一致。

03、討論

本研究開(kāi)發(fā)了一種一管28重基于STR分型的快速、經(jīng)濟(jì)的胎兒染色體非整倍體檢測(cè)方法。該方法通過(guò)一管PCR反應(yīng)進(jìn)行，與原試劑盒三管法相比進(jìn)一步節(jié)省了試劑成本和操作時(shí)。

通過(guò)316例健康人群的位點(diǎn)雜合度調(diào)查顯示，一管28重QF-PCR新方法，與原20重三管法相比，增加的21號(hào)染色體D21S1437、D21S1435和D21S11位點(diǎn)的雜合度分別為0.63、0.76、0.78，Zhu等[5]報(bào)道使用包含了D21S1437、D21S1435和D21S11共11個(gè)位點(diǎn)應(yīng)用于唐氏綜合征檢測(cè)，針對(duì)740例無(wú)關(guān)樣本判斷雜合度，得出該3個(gè)位點(diǎn)雜合度分別為70.4%、76.5%、81.4%，與本研究結(jié)果相類似。

18號(hào)染色體增加的D18S390、D18S978、D18S499位點(diǎn)雜合度分別為0.57