慢阻肺疾病氣道宿主-微生物相互作用的多組學分析確定了潛在的治療干預措施

氣道微生物組在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中的作用機制在很大程度上仍未被探索。本研究通過對我國99名COPD患者和36名健康個體的痰液宏基因組、代謝組、宿主轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組進行深入分析，展示了COPD中氣道微生物組-宿主相互作用的概況。

通過序列中介效應分析整合多組學數(shù)據(jù)，以評估微生物組與兩種主要COPD炎癥內(nèi)型(嗜中性粒細胞或嗜酸性粒細胞炎癥)的相關性。

利用微生物遺傳信息和建立的代謝物-人類基因?qū)Υ_定了“微生物組-代謝物-宿主”相互作用的假設。中性粒細胞為主的COPD的一個重要假設是氣道乳桿菌中色氨酸代謝的改變與吲哚-3-乙酸(IAA)的減少相關，這反過來又與受干擾的宿主白細胞介素-22(IL-22)信號傳導和上皮細胞凋亡途徑有關。

體內(nèi)和體外研究表明，氣道微生物衍生的IAA通過IL-22介導的巨噬細胞-上皮細胞相互作用減輕中性粒細胞炎癥、細胞凋亡、肺氣腫和肺功能下降。鼻內(nèi)接種兩種氣道乳桿菌可恢復IAA并重現(xiàn)其對小鼠的保護作用。這些研究結(jié)果為靶向COPD中微生物-宿主相互作用的治療手段提供了理論依據(jù)。

結(jié)果

COPD痰液宏基因組

本研究收集了廣州與深圳兩地共99例慢阻肺患者和36例健康對照的誘導痰進行多組學分析。宏基因組測序平均每個樣本產(chǎn)生1.83×108個高質(zhì)量reads。去除宿主reads后，平均保留1.53×107個微生物reads(保留reads的比例:1.8-71.8%)，從組裝的重疊群中產(chǎn)生2,901,665個非冗余微生物基因。

其中，1,722,043個基因(59.3%)被注釋到6678個KOs。隨著樣本量的增加，基因和KO水平的稀疏曲線都接近平臺期，表明有足夠的宏基因組覆蓋(補充圖1a)。在發(fā)現(xiàn)和驗證數(shù)據(jù)集中，COPD患者與分類和功能特征對照之間存在部分但的差異(圖1a)。位點與所有個體以及COPD患者和對照組的分類學和功能特征相關(分類學：R2=0.038，P=0.017；宏基因組：R2=0.047，P=0.017)。

來自基于reads的分類學中的31個物種在COPD和對照組之間差異豐富(錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.1)。Moraxella catarrhalis和Pseudomonas aeruginosa的相對豐度在COPD中增加多，而Prevotella intermedia在COPD中減少多。在這31個物種中，有20個與COPD在兩個部位具有相同的方向性。qPCR結(jié)果顯示COPD中細菌總量與對照組相比無明顯下降。

為了便于解釋COPD相關的微生物功能，我們將KO水平的關聯(lián)聚集到KEGG模塊中，通過使用Wilcoxon秩和檢驗將每個模塊中與COPD相關的所有KO水平與模塊外(背景)其余KO的水平進行比較。對于這些模塊，為每個樣本計算代表模塊富集程度的分數(shù)，從而產(chǎn)生維度降低的模塊級宏基因組圖譜(me[x]taG模塊)。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)細菌轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和氨基酸生物合成模塊在COPD患者中普遍富集，而減少的模塊包括能量代謝和氨基酸代謝。

不同的模塊組與痰中性粒細胞或嗜酸性粒細胞百分比相關，表明內(nèi)型特異性宏基因組特征。沒有分類群或功能模塊與吸煙狀況或吸入皮質(zhì)類固醇(ICS)的使用相關。為了在基因組水平上探索微生物組的變化，我們通過基于基因組特征的重疊群分箱來重建宏基因組物種(MGS)。

在總共產(chǎn)生的1,273個基因組分箱中(占所有重疊群序列的43.7%)，根據(jù)“MIMAG”標準，分別有384和82個符合中等和高質(zhì)量標準，其中384個bins包括66個種及40屬，涵蓋所有主要門，占總系統(tǒng)發(fā)育多樣性(Faith’s系統(tǒng)發(fā)育多樣性)的37.4%。COPD患者與對照組相比，MGS衍生物種的差異趨勢與基于reads的分類法得出的差異趨勢基本一致。

總體而言，這些結(jié)果表明COPD患者的氣道宏基因組發(fā)生了變化，其特點是氨基酸的合成代謝途徑相對于分解代謝途徑的比例增加。

采用Ward方法對模塊和樣本進行雙向?qū)哟尉垲?。模塊的樹狀圖沒有顯示。與肺活量(FEV1)和痰液差異細胞計數(shù)(NEU，中性粒細胞；EOS，嗜酸粒細胞；Mφ，巨噬細胞)的模塊水平Spearman相關性，以及模塊的功能類別顯示在熱圖旁邊。CckA，細胞周期組氨酸激酶A；ChpA，pil-chp組氨酸激酶A；ChpB，pil-chp組氨酸激酶B；CpdR，雙組分受體蛋白CpdR；CtrA，細胞周期轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子A；EHEC，腸出血性大腸桿菌；EPEC，腸致病性大腸桿菌；PleC，多效發(fā)育基因C；PleD，多效發(fā)育基因D；PTS，磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)；RpaAB，雙組分反應調(diào)節(jié)器RpaAB；SasA，聚球藻自適應傳感器A；tRNA，轉(zhuǎn)移核糖核酸。

d. Cladogram圖顯示COPD患者與對照組相比，384個MGS滿足中等及以上質(zhì)量，其完整性、污染和倍數(shù)變化。

COPD痰代謝組、宿主轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組

非靶向痰代謝組學產(chǎn)生了1,671種已知的代謝物。在COPD患者和健康個體之間觀察到了部分但的分離。

通過加權相關網(wǎng)絡分析(WGCNA，me[x]taB模塊)，將所有代謝物分為128個共豐度模塊。分別有37個和24個模塊在COPD中富集或減少。37個COPD富集模塊包含475種代謝物，其中35.6%是氨基酸、碳水化合物和類固醇。COPD中的氨基酸積累與其宏基因組中代謝的改變一致。

24個COPD減少的模塊包括275種代謝物，其中89個是磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺，這一結(jié)果也與COPD宏基因組中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺(P00564)的分解代謝增加相一致。

包含氨基酸、脂質(zhì)和膽汁酸的61個模塊中有38個與痰中性粒細胞相關，而16個模塊主要包含與嗜酸性粒細胞相關的磷脂酰膽堿

對于宿主轉(zhuǎn)錄組，所有19,142個人類基因被分成497個共豐度模塊(宿主轉(zhuǎn)錄組(HostT)模塊)。

其中，126個模塊在COPD患者和對照組之間差異表達，并且可以富集到經(jīng)典途徑(圖2c所示的前十個模塊；補充表6，FDR<0.05)。高的差異模塊與上皮細胞凋亡、氣道平滑肌收縮、hedgehog信號傳導和中性粒細胞細胞因子的產(chǎn)生有關。大多數(shù)差異模塊(88.9%)與嗜中性粒細胞相關，而與嗜酸性粒細胞趨化性、嗜酸性粒細胞蛋白釋放和肥大細胞遷移相關的14個模塊(11.1%)與嗜酸性粒細胞相關。卷積分析表明轉(zhuǎn)錄組差異是細胞組成差異和細胞內(nèi)基因表達變化的結(jié)果。

宿主蛋白質(zhì)組的分析確定了60種痰液和38種血清蛋白質(zhì)(宿主蛋白質(zhì)組(HostP))在COPD患者和對照組之間差異表達。雖然有個別模塊與吸煙或ICS相關，但整體的代謝組和宿主多組學特征與吸煙或ICS沒有明顯關聯(lián)(補充圖3和補充表5-7)。

總的來說，共同改變的微生物組、代謝組和宿主活動表明COPD中微生物-宿主的相互作用受到干擾。降維得到了113個me[x]tagome(me[x]taG)、61個代謝組(me[x]tab)、126個HostT模塊和98個HostP特征與COPD相關，確保了有足夠的統(tǒng)計能力進行綜合分析。

對于每種類型的組學數(shù)據(jù)，都有一組病情較輕的COPD患者與健康對照組相比顯示出有限的差異，這表明COPD的多組學變化特別是由疾病嚴重程度增加的患者驅(qū)動的。

a.主成分分析表明，COPD患者和健康對照組的代謝組、宿主轉(zhuǎn)錄組以及痰和血清蛋白質(zhì)組之間存在部分但的分離。

痰和血清蛋白質(zhì)組只針對發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集中的一部分個體進行了表征。b.痰代謝組的共豐度模塊。

為便于展示，顯示了COPD患者和健康對照組之間的前十個差異模塊。代謝物與肺活量(FEV1)和痰液差異細胞數(shù)(NEU、EOS、Mφ)的關聯(lián)，以及代謝物的功能類別顯示在熱圖旁邊。c.宿主轉(zhuǎn)錄組的共豐度模塊。只顯示了COPD患者和健康對照之間的前十個差異模塊。

基因水平與肺活量(FEV1)和痰液差異細胞數(shù)(NEU、EOS、Mφ)的關聯(lián)，以及該基因在富集程度高的通路中是否存在，都顯示在熱圖旁邊。d. COPD患者與健康對照組痰蛋白和血清蛋白的差異。AXL，AXL受體酪氨酸激酶；BCMA，腫瘤壞死因子受體超家族成員17；FGF-19，成纖維細胞生長因子19；GRO，生長調(diào)節(jié)α蛋白；HGF，肝細胞生長因子；ICAM-3，細胞間黏附分子3；LIF，白血病抑制因子；MCP-3，單核細胞趨化蛋白3；MDC，巨噬細胞衍生趨化因子；sRAGE，可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體；Tie-2，酪氨酸蛋白激酶受體TIE-2；VEGFR1，血管內(nèi)皮生長因子受體1