前沿丨深度解讀T細(xì)胞受體測序技術(shù)研究進(jìn)展

T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）是T細(xì)胞表面負(fù)責(zé)特異性識(shí)別與MHC（主要組織相容性復(fù)合體）結(jié)合的抗原肽的蛋白。當(dāng)TCR與抗原肽和MHC結(jié)合時(shí)，T淋巴細(xì)胞通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)被激活，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。人類基因組中有4個(gè)TCR基因：兩個(gè)編碼輕鏈TCR：TRA基因編碼TCRα，TRG基因編碼TCRγ；兩個(gè)編碼重鏈TCR：TRB基因編碼TCRβ，TRD基因編碼TCRδ；重鏈TCR和輕鏈TCR形成異源二聚體，組成完整的TCR。在人類中存在兩種TCR：TCRαβ和TCRγδ，其中95％的T細(xì)胞表達(dá)TCRαβ。成熟的重鏈TCR基因由可變區(qū)（V）、多變區(qū)（D）、連接區(qū)（J）和恒定區(qū)（C）四部分基因片段組成（VDJC），輕鏈TCR則缺少D區(qū)（VJC）。重鏈和輕鏈TCR都具有3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR），CDR在抗原識(shí)別中起主要作用：CDR1和CDR2相對(duì)保守，負(fù)責(zé)識(shí)別MHC；CDR3是與抗原直接接觸的TCR區(qū)域，CDR3由一部分V、全部D和J以及V-D、D-J之間連接區(qū)編碼，因此CDR3變化程度高。由于V（65~100種）、D（2種）、J（13種）基因片段本身具有多樣性，此外，在重排的過程中，VD及D-J的連接區(qū)經(jīng)常有非模板的核苷酸隨機(jī)插入或刪除，進(jìn)一步增加了CDR3區(qū)的多樣性，理論上會(huì)形成2×1019種TCRαβ。

由于在一個(gè)個(gè)體內(nèi)幾乎不會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)完全相同的V（D）J體細(xì)胞重排，所以TCR序列可作為T細(xì)胞克隆的獨(dú)特識(shí)別標(biāo)志。TCR這種特性可用于評(píng)估（1）抗原驅(qū)動(dòng)的T細(xì)胞克隆擴(kuò)增和反應(yīng)（圖1a和d）（2）縱向監(jiān)測T細(xì)胞反應(yīng)的克隆動(dòng)態(tài)和異質(zhì)性（圖1b和c）（3）在單個(gè)細(xì)胞中聯(lián)合評(píng)價(jià)TCR和細(xì)胞表型能夠提供T細(xì)胞分化通路和T細(xì)胞選擇的相關(guān)信息（圖1b）。這些信息不僅有助于理解免疫相關(guān)疾病的病因?qū)W，也可用于設(shè)計(jì)治療靶點(diǎn)。

TCR分析方法主要經(jīng)歷了三個(gè)發(fā)展階段。早期的TCR分析方法能夠揭示TCR庫的基本特征，但只是獲取部分序列信息，此階段以CDR3譜型分析和利用TRBV單克隆抗體的流式細(xì)胞術(shù)為代表。隨著基因組測序技術(shù)的興起，通過分子克隆和Sanger測序能夠在核苷酸分辨率水平捕獲TCR信息，可更精確的評(píng)價(jià)CDR3多樣性。此外，這些方法第一次實(shí)現(xiàn)了同時(shí)評(píng)估TCRα和TCRβ序列多樣性，并且發(fā)現(xiàn)，在一個(gè)個(gè)體中初始T細(xì)胞庫具有高度多樣性而記憶T細(xì)胞對(duì)總TCR庫多樣性貢獻(xiàn)較小。二代測序技術(shù)在過去二十年中發(fā)展迅速并逐漸普及，TCR檢測的靈敏度和TCR發(fā)現(xiàn)工具性能得到極大提升。目前，在一次分析中可同時(shí)檢測103-106 TCR。本綜述主要討論在細(xì)胞群體水平和單細(xì)胞水平利用高通量測序技術(shù)分析TCR庫的方法學(xué)進(jìn)展以及將TCR序列與抗原特異性配對(duì)的技術(shù)，并重點(diǎn)關(guān)注這些技術(shù)如何加深我們對(duì)于健康和疾病狀態(tài)下T細(xì)胞克隆動(dòng)態(tài)、分化以及反應(yīng)軌跡的理解。

研究結(jié)果

1. TCR測序的分子策略

利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行TCR庫分析，可以實(shí)現(xiàn)在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)分析數(shù)以百萬計(jì)的T細(xì)胞（圖1a）。這些方法通常采用以下兩種擴(kuò)增策略中的一種：（1）多重PCR（2）5’互補(bǔ)端快速擴(kuò)增（5’RACE）。

多重PCR

由于TCR V基因巨大的多樣性，一對(duì)引物不足以捕獲所有的TCR轉(zhuǎn)錄本，所以出現(xiàn)了多重PCR反應(yīng)。多重PCR方法使用一組與已知V基因互補(bǔ)的正向引物和一組與J或C區(qū)域互補(bǔ)的反向引物。在這種引物擴(kuò)增策略中，首先從T細(xì)胞中分離gDNA或RNA，然后采用上述引物對(duì)進(jìn)行多輪PCR擴(kuò)增，這些引物同時(shí)含有用于后續(xù)高通量測序的通用序列。Robins等采用這種方法進(jìn)行深度CDR3β測序發(fā)現(xiàn)，TCR庫呈現(xiàn)出特定V-J重排偏好。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同個(gè)體之間初始CDR3β的重合程度遠(yuǎn)高于平均水平。這些結(jié)果表明TCR庫并非隨機(jī)產(chǎn)生的，而存在對(duì)某種重排的偏好，這可能是由于在胸腺發(fā)育過程中經(jīng)歷了共同抗原的緣故。

此種依賴于多重PCR擴(kuò)增的方法會(huì)引入測序偏好和錯(cuò)誤，從而無法獲得TCR多樣性的真實(shí)情況。目前有幾種策略用于減小這種偏好，例如，由于cDNA轉(zhuǎn)錄本已經(jīng)是經(jīng)過剪切的，所以使用mRNA可以采用更少的反向引物以靶向C區(qū)域，從而降低了來自多重J引物PCR擴(kuò)增的偏好性。相反，采用gDNA測序能夠避免反轉(zhuǎn)錄，從而降低在cDNA合成過程中引入錯(cuò)誤的可能。此外，采用合成TCR分子靶向多重引物可以在多重PCR前后定量模板，從而優(yōu)化引物濃度并校正擴(kuò)增偏好。

5’ RACE

第二種TCR測序方法是基于5’ RACE，這種方法需要使用具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄RNA，從而在cDNA的3’ 端加入非模板C寡核苷酸，用于下游的cDNA擴(kuò)增，非模板C寡核苷酸叫做模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸（Template switch oligo，TSO）。在第一鏈合成過程中，當(dāng)?shù)竭_(dá) RNA 模板的 5' 末端時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性會(huì)在新合成的 cDNA 鏈的 3' 末端添加一些額外的核苷酸。這些堿基充當(dāng)模板轉(zhuǎn)換 (TS) 寡核苷酸錨定位點(diǎn)。在 TS 寡核苷酸和附加的脫氧胞苷片段之間進(jìn)行堿基配對(duì)后，逆轉(zhuǎn)錄酶“轉(zhuǎn)換”模板鏈，從細(xì)胞 RNA 到 TS 寡核苷酸，并繼續(xù)復(fù)制到 TS 寡核苷酸的 5' 端。這種方法可以得到包含完整 5' 端的cDNA，這意味著可以保留完整的V基因序列。5’ RACE法需要較少的PCR擴(kuò)增，與多重PCR法相比可以降低擴(kuò)增偏好，然而這些方法仍然會(huì)存在來自PCR、模板轉(zhuǎn)換以及測序的錯(cuò)誤。

TCR擴(kuò)增方法的錯(cuò)誤矯正策略

由于上述TCR測序策略可能存在的偏好和錯(cuò)誤，引入獨(dú)特分子標(biāo)簽（UMIs）可以有效矯正這些錯(cuò)誤。UMIs是一系列隨機(jī)DNA序列，在cDNA合成過程中被加入cDNA中并標(biāo)記一條cDNA分子。這種策略有兩個(gè)優(yōu)勢：（1）通過計(jì)數(shù)每種UMI的數(shù)目可以得到樣本中TCR序列的原始分布，這有助于更精確的定量TCR克隆頻率；（2）通過將具有相同UMI的reads聚集在一起可以有效矯正PCR和測序錯(cuò)誤，從而可以推斷出真實(shí)的TCR序列。由于TCRs序列之間的差異僅有幾個(gè)核苷酸，這種矯正步驟可以區(qū)分真實(shí)的TCR變異和錯(cuò)誤導(dǎo)致的假性多樣性，所以可以更準(zhǔn)確地評(píng)估TCR庫多樣性。然而，獲得準(zhǔn)確度的代價(jià)是較低的靈敏度，因?yàn)榈皖l克隆可能由于每個(gè)UMI覆蓋的read不足而被過濾掉。目前已經(jīng)開發(fā)出對(duì)每個(gè)核苷酸進(jìn)行錯(cuò)誤矯正的算法，這可以更精確地測量TCR庫中的克隆型頻率。

TCR靶向測序方法的比較

由于TCR庫測序方法不同，所以在分析測序結(jié)果時(shí)應(yīng)考慮以下幾個(gè)因素：首先，是采用DNA還是RNA，這決定了可以適用哪種測序方法。上述兩種方法均可用于RNA，然而，如果RNA質(zhì)量欠佳，則gDNA多重?cái)U(kuò)增法則可能是更好地選擇（表1）。其次，TCR測序的目的也會(huì)影響測序方法的選擇。例如，RNA測序結(jié)果無法直接與細(xì)胞數(shù)目相關(guān)聯(lián)。所以，如果研究目標(biāo)是定量某個(gè)T細(xì)胞群的克隆擴(kuò)增，則gDNA法是更好的選擇，因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞只有一個(gè)TCR基因組拷貝。類似地，由于多重PCR使用靶向V基因不同區(qū)域的多組引物，所以基本無法獲取跨越整個(gè)V（D）J區(qū)域的全長TCR序列，這種方法足以分析具有高變異程度的CDR3區(qū)，然而，如果擬回答的生物學(xué)問題需要評(píng)價(jià)CDR1和CDR2等其他區(qū)域，則5’ RACE法更為合適。

此外，兩種TCR測序方法每一步的技術(shù)特點(diǎn)也會(huì)對(duì)TCR庫結(jié)果和后續(xù)解釋產(chǎn)生巨大影響。在近期一項(xiàng)對(duì)多重PCR和5’ RACE進(jìn)行TCR測序的方法學(xué)比較研究中，Barennes等在相同的T細(xì)胞群體樣本中，評(píng)價(jià)了9種TCR測序流程以比較其可重現(xiàn)性、可重復(fù)性以及靈敏度。他們檢測到方法特異性組庫特征在不同重復(fù)間，存在高度一致性，這意味著每種方法會(huì)產(chǎn)生特定的偏好。通過比較采用流式細(xì)胞術(shù)得到的TRB使用結(jié)果，他們觀察到，相比于基于gDNA的多重PCR或5’ RACE法，基于RNA的多重PCR方法呈現(xiàn)出特定V基因更偏的測序結(jié)果，這可能反映了RNA轉(zhuǎn)錄本豐度差異引起的擴(kuò)增偏好。無論采用何種方法，獲得真實(shí)反映生物學(xué)免疫組庫的測序結(jié)果很大程度上取決于起始核酸量，尤其是在檢測罕見TCR序列方面。如果一項(xiàng)研究的目標(biāo)是獲取大TCR多樣性或檢測罕見克隆型，則應(yīng)優(yōu)先考慮選擇采用非UMI的5’ RACE法，因?yàn)檫@種方法比基于UMI的方法靈敏度更高，尤其是對(duì)于TCRα鏈。相反，如果目標(biāo)是構(gòu)建TCR庫的代表性克隆結(jié)構(gòu)或者是在擴(kuò)增水平基礎(chǔ)上識(shí)別感興趣的TCRs，則帶UMI的5’ RACE法也許更合適，因?yàn)檫@種方法更忠實(shí)地保留TCR克隆型頻率，盡管需要幾個(gè)重復(fù)或者更高的測序深度以捕獲低頻克隆。

以上方法均是基于細(xì)胞群體的TCR庫測序，然而，這種基于細(xì)胞群體的TCR庫測序方法無法分辨配對(duì)的TCRα和TCRβ，因?yàn)橐淮沃荒塬@取一條鏈。由于TCR是以二聚體的形式識(shí)別抗原的，所以這種方法限制了抗原特異性的評(píng)價(jià)。此外，TCRαβ克隆型分析更加準(zhǔn)確，因?yàn)橄嗤腡CRβ序列可能與不同的TCRα序列配對(duì)。所以，只考慮一條鏈可能低估TCR多樣性、混淆克隆內(nèi)表型分析以及無法準(zhǔn)確識(shí)別免疫反應(yīng)相關(guān)T細(xì)胞抗原特異性。

2. 配對(duì)TCRαβ的高通量測序方法

捕獲配對(duì)TCRαβ測序能夠更加準(zhǔn)確地分辨TCR庫中的克隆結(jié)構(gòu)、評(píng)價(jià)TCR功能以及抗原特異性。捕獲配對(duì)TCRαβ測序可通過兩種途徑實(shí)現(xiàn)：（1）采用基于組合的策略計(jì)算推斷TCRαβ配對(duì)（2）采用分離的單細(xì)胞進(jìn)行TCRα和TCRβ同時(shí)測序。

組合推斷TCRαβ配對(duì)

第一種基于組合策略計(jì)算推斷TCRαβ配對(duì)的方法稱為pairSEQ。在這種方法中，T細(xì)胞隨機(jī)分布于96孔板中，每個(gè)孔含有帶有相同DNA barcode的一群細(xì)胞（圖2a）。收集所有樣本測序，將帶有相同barcode的TCRα和TCRβ序列進(jìn)行計(jì)算匹配并確認(rèn)配對(duì)，由于TCR重排的高度多樣性，出現(xiàn)帶有相同barcode的兩個(gè)克隆的可能性極低。這種基于頻率的配對(duì)方法的缺點(diǎn)是只有擴(kuò)增克隆可以被檢測配對(duì)，所以不適合發(fā)現(xiàn)罕見TCRαβ序列。

單細(xì)胞TCR測序技術(shù)

單細(xì)胞分離技術(shù)的進(jìn)步使獲得配對(duì)TCRαβ鏈信息成為可能。早期的單細(xì)胞配對(duì)TCRαβ分析方法依賴于通過顯微操作分離單個(gè)T細(xì)胞，再進(jìn)行多重PCR和Sanger測序，然而這類方法耗時(shí)且效率和通量受限。目前，普遍采用的分離單細(xì)胞方法是采用熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)（FACS）。這種方法的優(yōu)勢是可以對(duì)感興趣的細(xì)胞類群基于細(xì)胞表面分子標(biāo)志物進(jìn)行富集測序，而不用對(duì)樣本中所有T細(xì)胞進(jìn)行測序，這有助于分析罕見細(xì)胞亞群。這種方法可保證較高的測序質(zhì)量和測序深度，從而產(chǎn)生更可信的TCR序列，這對(duì)于分析克隆多樣性非常重要。在這種方法中，根據(jù)各種細(xì)胞表面不同蛋白結(jié)合不同熒光抗體并被單獨(dú)分選至微滴孔板中，可以一次性分離數(shù)百個(gè)單細(xì)胞。然后，TCR鏈被逆轉(zhuǎn)錄并采用多重PCR法進(jìn)行靶向擴(kuò)增。研究者采用此方法分析抗原特異性CD8+ T細(xì)胞對(duì)于病毒感染的反應(yīng)，并顯示出較以往方法顯著更高的雙等位基因TCRα表達(dá)頻率。對(duì)這種基于FACS的分離方法的改進(jìn)包括通過使用基于PCR的barcode策略進(jìn)行高通量測序。例如，在Han等描述的方法中，在巢式PCR擴(kuò)增之后，通過引入PCR延伸步驟對(duì)每孔樣本進(jìn)行獨(dú)特寡核苷酸標(biāo)記（圖2a）。這些barcode保留了轉(zhuǎn)錄本起源的信息，從而在保留TCRαβ鏈配對(duì)信息的同時(shí)可以進(jìn)行不同樣本混合的高通量測序。

另一種單細(xì)胞配對(duì)TCRαβ測序策略是基于細(xì)胞的乳化PCR方法。這類方法中，單細(xì)胞被捕獲在油包水的乳化液滴中，其中含有TCR引物和RT-PCR試劑，經(jīng)過OE-PCR（overlap extension RT-PCR）將TCRα和TCRβ轉(zhuǎn)錄本連接起來，然后融合的TCRαβ轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行富集、擴(kuò)增和測序（圖2b）。利用此乳化OE-PCR法，Munson等識(shí)別出存在于乳腺癌患者中的共享TCRαβ克隆，這說明共享抗原可引起抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)，而非患者特異的新抗原。

3. 利用單細(xì)胞TCR測序識(shí)別T細(xì)胞狀態(tài)及功能

在單細(xì)胞水平上獲取TCR序列信息是一大技術(shù)進(jìn)步，進(jìn)一步研究特定細(xì)胞狀態(tài)下的TCR庫能夠提供更加全面的關(guān)于T細(xì)胞免疫反應(yīng)的功能和生理信息。幾個(gè)課題組開發(fā)出將TCR測序與其他組學(xué)方法進(jìn)行整合的分析方法（圖1b-d）。其中一類方法能夠同時(shí)檢測單個(gè)細(xì)胞的TCR和轉(zhuǎn)錄組，主要通過以下兩種途徑實(shí)現(xiàn)：（1）從單細(xì)胞測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)計(jì)算重構(gòu)TCR鏈；（2）聯(lián)合基因表達(dá)譜，特異性擴(kuò)增TCR位點(diǎn)。

通過計(jì)算TCR重建將TCR與T細(xì)胞表型進(jìn)行配對(duì)

從scRNA-seq數(shù)據(jù)提取TCR信息的計(jì)算方法通常依賴于結(jié)合比對(duì)和重頭組裝步驟來確認(rèn)TCR來源的reads并重構(gòu)TCR鏈（圖3c和表2）。利用已知scRNA-seq方法進(jìn)行TCR重構(gòu)的一大挑戰(zhàn)在于，依賴于擴(kuò)增3’端轉(zhuǎn)錄本的方法不會(huì)捕獲V（D）J所在的5’端。為了解決這個(gè)問題，研究者開發(fā)出利用全長cDNA擴(kuò)增和測序的新方法，這種方法中，利用類似于5’RACE的模板轉(zhuǎn)換機(jī)制來進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄（圖3b）。在片段化和測序后，單個(gè)TCR序列被計(jì)算重構(gòu)并在其特定表型譜中進(jìn)行分析。目前用于TCR重構(gòu)的算法主要包括scTCRseq、TraCeR、VDJPuzzle以及TRAPeS。

通過結(jié)合TCR序列和基因表達(dá)譜，這些計(jì)算方法提供了T細(xì)胞克隆表型動(dòng)態(tài)的初步景觀。一項(xiàng)研究采用TraCeR算法對(duì)來自鼠沙門氏菌感染的CD4+ T細(xì)胞的scRNA-seq進(jìn)行分析，通過將重構(gòu)TCR與其細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行配對(duì)，作者追蹤了在感染過程中，從激活到T輔助細(xì)胞，再到效應(yīng)記憶T細(xì)胞狀態(tài)的分化軌跡，這表明單個(gè)克隆可能經(jīng)歷多種不同的細(xì)胞命運(yùn)。

盡管這些方法能夠充分利用先前產(chǎn)出的scRNA-seq數(shù)據(jù)，然而成功重構(gòu)TCR依賴于測序深度和TCR位點(diǎn)的表達(dá)水平，這在不同細(xì)胞中變異較大。所以，測序深度不夠或者起始底物濃度太低都可能無法完全重構(gòu)TCR庫，并可能影響基于此的關(guān)于克隆性和多樣性的生物學(xué)解釋。

通過同時(shí)進(jìn)行RNA和靶向TCR測序?qū)CR與T細(xì)胞表型進(jìn)行配對(duì)

為了獲得更高覆蓋度的TCR測序文庫，幾個(gè)課題組開發(fā)了將單細(xì)胞中RNA譜與靶向TCR雙鏈擴(kuò)增進(jìn)行結(jié)合的方法（圖3a）。其中一種方法采用多重PCR策略同時(shí)靶向TCRα和TCRβ鏈以及一個(gè)包含17個(gè)表型基因的panel，這些表型基因包括對(duì)于T細(xì)胞功能和亞型決定至關(guān)重要的細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子。采用這種方法，研究者分析了結(jié)直腸癌的CD4+腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞特征并發(fā)現(xiàn)在FOXP3+RORC+和FOXP3-RORC+ T helper 17 (TH17) 細(xì)胞亞群之間存在共享克隆，這表明產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞可來源于共同的祖先，這些祖先細(xì)胞在對(duì)抗原的反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增并分化出不同的表型。這些結(jié)果再一次印證了，在激活免疫反應(yīng)過程中，CD4+ T細(xì)胞能夠呈現(xiàn)出譜系可塑性。此外，這項(xiàng)研究表明FOXP3+ T細(xì)胞在腫瘤免疫中的復(fù)雜作用，尤其是與IL-17表達(dá)聯(lián)合分析。

后續(xù)研究進(jìn)一步擴(kuò)展了將單細(xì)胞中RNA譜與靶向TCR雙鏈擴(kuò)增進(jìn)行結(jié)合分析的通量。主要包括InDrop法（圖3a，紅線）、利用生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針比對(duì)到C區(qū)域的方法（圖3a，紫線）（表1）以及RAGE-seq法（圖3a，綠線），這些方法均采用捕獲全長TCR測序，然而，由于nanopore測序的高錯(cuò)誤率和多重測序需求，這些方法TCR回收率較低，并限制了廣泛使用。

此外，采用5’ RNA擴(kuò)增同時(shí)進(jìn)行scRNA-seq和TCR測序的方法被開發(fā)出來。在這種方法中，與3’ 端scRNA-seq類似，細(xì)胞被包裹在含有barcode beads的液滴中，然而，與3’ 端scRNA-seq不同的是，barcode添加在與TSO相鄰的cDNA 5’ 端（圖3a，藍(lán)線）。全長cDNA被富集并采用通用引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將cDNA分為兩部分，一部分用來進(jìn)行TCR轉(zhuǎn)錄本靶向富集并比對(duì)至TCR恒定區(qū)，另一部分直接用于構(gòu)建基因表達(dá)文庫。這種5’ 端捕獲方法被10x Genomics商業(yè)化并進(jìn)一步加深了對(duì)于T細(xì)胞反應(yīng)特性的理解，尤其在癌癥研究中。Azizi等分析了人類乳腺癌腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）組成，以考察TCR庫多樣性與T細(xì)胞表型多樣性的關(guān)系。整合細(xì)胞狀態(tài)和TCR克隆型數(shù)據(jù)可揭示T細(xì)胞激活的連續(xù)軌跡，這可部分用TCR多樣性來解釋。此外，作者發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞克隆主要集中于表型相關(guān)的細(xì)胞亞群，這些亞群表達(dá)相似的特征，比如失能和糖異生，這表明細(xì)胞狀態(tài)很大程度上由TCR刺激和環(huán)境因素所決定。Yost等也利用此方法追蹤抗PD-1治療前后T細(xì)胞克隆動(dòng)態(tài)，結(jié)果表明，治療后擴(kuò)增的CD8+ T細(xì)胞群主要包括此前未在腫瘤中的耗竭型克隆，這表明免疫檢查點(diǎn)抑制劑通過招募新的T細(xì)胞克隆而非重新激活腫瘤中已經(jīng)存在的耗竭型克隆發(fā)揮作用。

將TCR與表面蛋白進(jìn)行配對(duì)

在單細(xì)胞水平同時(shí)分析TCR和轉(zhuǎn)錄譜能夠提供高分辨率的T細(xì)胞狀態(tài)信息。然而，利用蛋白表達(dá)進(jìn)行T細(xì)胞表型分析可以更清晰的定義T細(xì)胞亞群，因?yàn)槟承┨囟?xì)胞類型的標(biāo)志物在轉(zhuǎn)錄水平很難被檢測到。此外，單細(xì)胞蛋白檢測能夠更好解決以下問題：（1）亞型使用，這對(duì)于識(shí)別表達(dá)PTPRC、CD45RO和CD45RA基因的效應(yīng)和記憶T細(xì)胞群尤為重要；（2）細(xì)胞內(nèi)蛋白活性和修飾，譬如關(guān)鍵T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的激活。為了解決上述問題，Mimitou等近期報(bào)道了一種稱為ECCITE-seq的方法，該方法擴(kuò)展了5’ 端scRNA-seq和TCR測序方法，以捕獲細(xì)胞表面蛋白并同時(shí)檢測基因表達(dá)和TCR庫。該方法通過將與TSO互補(bǔ)的寡核苷酸耦連帶有DNA-barcode的抗體來檢測蛋白。ECCITE-seq可被擴(kuò)展用于從CRISPR庫中直接捕獲single guide RNAs（sgRNA）并同時(shí)進(jìn)行RNA、蛋白以及TCR測序。

將TCR與染色質(zhì)可及性進(jìn)行配對(duì)

聯(lián)合單細(xì)胞TCR捕獲和ATAC-seq分析特定細(xì)胞環(huán)境下的TCR序列，ATAC-seq是一種衡量基因組范圍內(nèi)染色質(zhì)可及性的技術(shù)（圖1c）。這種方法可以探索表觀因子包括反式作用元件和順式作用因子在驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞特異性和克隆擴(kuò)增中的作用。例如，這種方法被用于識(shí)別之前采用標(biāo)準(zhǔn)FACS方法未能檢測的淋巴瘤惡性T細(xì)胞克隆，并且有希望應(yīng)用于提升目前鑒別良惡性T細(xì)胞增殖的診斷效力，為臨床治療提供表觀組學(xué)靶點(diǎn)。

4. 將TCR序列映射到抗原特異性的策略

結(jié)合抗原特異性與T細(xì)胞克隆性以及表型檢測對(duì)于理解T細(xì)胞反應(yīng)的驅(qū)動(dòng)因素至關(guān)重要（圖1d）。T細(xì)胞抗原識(shí)別的幾方面問題對(duì)將TCR序列映射至特異性構(gòu)成了挑戰(zhàn)，首先，抗原特異性T細(xì)胞頻率極低，大約為百萬分之一，檢測這些細(xì)胞將極為困難；其次，由于MHC的多態(tài)性、TCR和pMHC的多特異性以及單個(gè)抗原編碼的多個(gè)可能抗原表位，使得解析TCR抗原特異性變得異常復(fù)雜；后，多數(shù)TCR-pMHC相關(guān)作用的親和性較弱，這使得選擇性分離抗原特異性T細(xì)胞群成為一項(xiàng)艱巨的工作。

已經(jīng)有多種評(píng)價(jià)T細(xì)胞抗原特異性的方法，我們重點(diǎn)關(guān)注同時(shí)包含TCR測序的方法。其中一種研究抗原特異性T細(xì)胞的經(jīng)典方法包括通過流式細(xì)胞術(shù)使用熒光標(biāo)記的pMHC多聚物來分離識(shí)別特定MHC分子下特異性多肽的T細(xì)胞。然后，對(duì)抗原特異性T細(xì)胞群進(jìn)行TCR測序或配對(duì)單細(xì)胞TCR和表型分析。這種方法通量較低，目前已經(jīng)開發(fā)出能同時(shí)檢測特異性數(shù)量的改進(jìn)方法，主要通過添加DNA和磁性納米顆粒barcode提高多聚TCR特異性檢測，目前可同時(shí)檢測1000以上的多肽特異性。然而這些方法只識(shí)別T細(xì)胞的抗原特異性，后來研究者又開發(fā)出同時(shí)捕獲TCR的方法，這種方法可以刻畫抗原特異性T細(xì)胞群的克隆性和TCR序列變異。TetTCR-seq就采用了這種方法，T細(xì)胞識(shí)別并結(jié)合帶有DNA-barcode的pMHC四聚體從而被著色，然后采用FACS分選至單細(xì)胞孔（圖4a）。隨后同時(shí)對(duì)每個(gè)單個(gè)細(xì)胞的TCRαβ轉(zhuǎn)錄本和DNA barcode進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，細(xì)胞barcode可用于在單細(xì)胞水平將TCR序列與其同源抗原進(jìn)行配對(duì)。Zhang等采用此方法同時(shí)篩選出超過150中癌新抗原和野生型多肽對(duì)，這說明可以利用TetTCR-seq高通量識(shí)別具有功能活性的新抗原特異性TCR。

另一種同時(shí)檢測抗原特異性和TCR序列的高通量方法采用了微流控技術(shù)。MATE-seq即為此類方法之一，這種方法使用磁珠納米顆粒標(biāo)記的pMHC四聚體，并連接光可切割的TCR特異性引物以在同一個(gè)液滴中同時(shí)捕獲TCR序列和抗原（圖4b）。具體來說，將T細(xì)胞與被納米顆粒標(biāo)記的pMHC文庫進(jìn)行孵育，并用磁珠進(jìn)行分離純化，將單細(xì)胞包裹在液滴中并裂解，納米顆粒標(biāo)記的pMHC暴露于UV中，從而釋放靶向TCRαβ區(qū)域的RT-PCR引物。由于這些引物連接的一個(gè)DNA barcode對(duì)應(yīng)相應(yīng)的pMHC，在經(jīng)歷混合測序后，TCR序列和抗原特異性能夠在單細(xì)胞水平被耦連起來。盡管這些改進(jìn)極大提升了通量和將TCR序列映射到抗原特異性的分辨率，然而這些方法只適用于識(shí)別一個(gè)已知抗原特異性的相應(yīng)T細(xì)胞，且需要對(duì)感興趣的多肽預(yù)先設(shè)定。

5. TCR測序數(shù)據(jù)收集標(biāo)準(zhǔn)

高通量測序方法產(chǎn)生了海量TCR測序數(shù)據(jù)，隨之而來的問題是如何標(biāo)準(zhǔn)化TCR測序數(shù)據(jù)以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)可重復(fù)性和共享。適應(yīng)性免疫受體庫委員會(huì)（AIRR）定義了關(guān)于適應(yīng)性免疫受體庫的小信息標(biāo)準(zhǔn)（MiAIRR），這是一套報(bào)告抗體和TCR測序研究中元數(shù)據(jù)的指導(dǎo)方針，包括研究設(shè)計(jì)的細(xì)節(jié)、樣本處理方法、數(shù)據(jù)處理過程、注釋以及提交NCBI的規(guī)范。然而，仍然需要持續(xù)的努力來定義數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，且鼓勵(lì)研究者遵循這些指導(dǎo)方針將有助于促進(jìn)各個(gè)采用TCR測序技術(shù)的研究團(tuán)體達(dá)成持續(xù)合作，以形成健康的學(xué)術(shù)生態(tài)。

展望

盡管TCR測序領(lǐng)域進(jìn)展迅速，然而，更快、更靈敏、更低成本仍然是我們追求的目標(biāo)，尤其對(duì)于單細(xì)胞方法。目前基于液滴的測序方法可達(dá)到約65%的單線態(tài)捕獲率。這種低捕獲率限制了研究結(jié)果的可解釋性，因?yàn)樵谝淮螜z測中被捕獲的細(xì)胞可能無法代表原始的細(xì)胞群體，特別是分析諸如外周血和其他免疫相關(guān)器官這種大樣本細(xì)胞的情況。目前基于液滴的單細(xì)胞技術(shù)的另一個(gè)局限性是每次捕獲小投入量為近1000個(gè)細(xì)胞，這妨礙了分析罕見亞群，譬如抗原特異性T細(xì)胞群。此外，雖然微流控單細(xì)胞方法相比于傳統(tǒng)基于孔板的方法成本顯著降低，采用單細(xì)胞檢測TCR庫的成本仍然高于基于細(xì)胞群體的方法。新近出現(xiàn)的微孔檢測技術(shù)可能為克服以上局限性提供了一種選擇，這種微孔檢測技術(shù)能夠兼容較低的細(xì)胞投入量且比基于液滴的方法效率更高。除了以上技術(shù)改進(jìn)，還可以通過結(jié)合不同技術(shù)的正交策略更細(xì)致地研究T細(xì)胞克隆性和生理功能。

后，單細(xì)胞遺傳譜系追蹤的方法利用DNA barcode來標(biāo)記細(xì)胞及其后代，這種方法在研究造血和其他大量生物學(xué)問題方面顯示出巨大價(jià)值。將譜系追蹤和TCR庫結(jié)合起來能夠幫助我們更細(xì)致地理解T細(xì)胞的發(fā)育軌跡和表型可塑性。然而這些方法在應(yīng)用于生理環(huán)境，譬如人類組織之前需要多次迭代，每一次進(jìn)步無疑會(huì)使我們更好地理解機(jī)體如何協(xié)調(diào)T細(xì)胞反應(yīng)的機(jī)制，進(jìn)而幫助我們開發(fā)更好的癌癥、感染以及免疫相關(guān)疾病治療策略。