臨床分子診斷技術(shù)在疾病診療中的應(yīng)用價值與相關(guān)問題

分子診斷技術(shù)是指以DNA或RNA核酸為診斷材料，利用核酸擴(kuò)增等分子生物學(xué)手段，檢測靶標(biāo)基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，從而對疾病作出診斷的技術(shù)。目前分子診斷技術(shù)正處于高速發(fā)展時期，各類創(chuàng)新技術(shù)不斷取得突破，除實(shí)時熒光PCR技術(shù)外，近年來分子診斷領(lǐng)域不斷發(fā)展新的技術(shù)方法，應(yīng)用范圍也在不斷拓展。

尤其是新冠疫情以來，在感染性疾病病原分子診斷細(xì)分領(lǐng)域，國內(nèi)外的體外診斷技術(shù)研發(fā)機(jī)構(gòu)和企業(yè)各顯神通，各種新型核酸檢測技術(shù)不斷涌現(xiàn)。以新型冠狀病毒核酸檢測試劑的臨床應(yīng)用為例，目前獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局第三類醫(yī)療器械注冊證的核酸檢測試劑共計30余種，除了經(jīng)典的實(shí)時熒光PCR法，還包括等溫擴(kuò)增技術(shù)等多種新型核酸檢測技術(shù)。相比疫情前的分子診斷產(chǎn)品，我們切實(shí)感受到技術(shù)進(jìn)步和工藝優(yōu)化帶來的新變化。本期主要對分子診斷技術(shù)，重點(diǎn)是在感染性疾病診斷的應(yīng)用發(fā)展及存在的問題進(jìn)行討論。 （ 作者：陳瑜  單位：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科/浙江省臨床體外診斷技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所 ）

01 實(shí)時熒光PCR技術(shù) 實(shí)時熒光PCR（Real-time PCR）核酸檢測技術(shù)仍然是當(dāng)前分子診斷領(lǐng)域應(yīng)用廣的技術(shù)，逐漸成為病原診斷的主要手段之一。 通過引物設(shè)計、反應(yīng)條件優(yōu)化等，研發(fā) 能同時覆蓋多個病原的多重PCR技術(shù) 是主要趨勢，如羅氏Cobas 4800 HPV檢測系統(tǒng)通過單管反應(yīng)可以得到HPV 16型、18型和其他12種高風(fēng)險亞型的篩查結(jié)果。 

同時，如何 實(shí)現(xiàn)實(shí)時熒光PCR快速擴(kuò)增與檢測 也是當(dāng)前研究熱點(diǎn)，例如研發(fā)新型熱循環(huán)儀，針對性提高升降溫速率，目前接觸式熱循環(huán)儀（如連續(xù)流、振蕩流等）和非接觸式熱循環(huán)儀（如等離子體、激光等）的研究均取得一定進(jìn)展。此外還可以通過改進(jìn)PCR反應(yīng)管的光傳導(dǎo)和熱傳導(dǎo)效率，如Cepheid采用扁平結(jié)構(gòu)的反應(yīng)管，以實(shí)現(xiàn)快速實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增與檢測。

還有研究者利用新型薄膜硅基微加熱器，升溫速率達(dá)到30°C/s。另外，通過采用極速反應(yīng)酶和一步法提取試劑也能極大的縮短檢測時間，如2020年上市的圣湘生物、卡尤迪和達(dá)安基因的新冠病毒快速核酸檢測系統(tǒng)。 自動化 也是實(shí)時熒光PCR分子診斷發(fā)展的一個重要方向，尤其在新冠疫情常態(tài)化防控工作中，臨床實(shí)驗(yàn)室的需求更加迫切，以羅氏COBAS 6800/8000全自動分子診斷系統(tǒng)為例，這類系統(tǒng)大大減少了手工操作，降低了環(huán)境和人員影響，更保證了實(shí)驗(yàn)室人員的生物安全。近年來，國內(nèi)品牌如廈門安普利、上海仁度和安圖生物的全自動核酸檢測分析系統(tǒng)陸續(xù)獲準(zhǔn)上市。 

02 等溫核酸擴(kuò)增技術(shù) 核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)是指在某一恒定溫度、由特定酶作用完成靶標(biāo)核酸擴(kuò)增和相關(guān)信號檢測的技術(shù)。相比于PCR核酸擴(kuò)增技術(shù)，等溫核酸擴(kuò)增不需要熱循環(huán)儀，基于該技術(shù)開發(fā)的分子診斷系統(tǒng)具有 操作簡便、檢測過程快速高效、儀器易小型化和易普及 等多重優(yōu)點(diǎn)，因此，基于該技術(shù)研發(fā)的分子診斷產(chǎn)品特別適用于對檢測速度要求較高的海關(guān)口岸，以及檢測技術(shù)力量和基礎(chǔ)薄弱的基層醫(yī)療單位。經(jīng)過十多年的發(fā)展，目前已有多種等溫擴(kuò)增技術(shù)用于分子診斷領(lǐng)域，其中目前常見的核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP)、依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（NASBA）、切口和延伸擴(kuò)增反應(yīng)技術(shù)（NEAR）、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）等。 LAMP技術(shù)是日本學(xué)者Notomi在2000年提出的，是目前分子診斷領(lǐng)域應(yīng)用為廣泛的恒溫擴(kuò)增技術(shù)，目前已開發(fā)有多種分子診斷產(chǎn)品及配套系統(tǒng)，如博奧生物公司晶芯®RTisochipTM-A，Meridian Bioscience的Alethia系列產(chǎn)品等。依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（NASBA）是Compton在1991年提出的一種核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)，之后美國Gen-Probe公司以及上海仁度公司以M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶替代NASBA中AMV逆轉(zhuǎn)錄酶功能和RNase H酶水解活性，分別構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增（TMA）和RNA恒溫擴(kuò)增實(shí)時熒光檢測技術(shù)（SAT）。 切口和延伸擴(kuò)增反應(yīng)（NEAR）主要由逆轉(zhuǎn)錄酶、切口酶和恒溫擴(kuò)增DNA聚合酶驅(qū)動，并利用分子信標(biāo)產(chǎn)生熒光信號用于結(jié)果分析。該技術(shù)開發(fā)的分子診斷產(chǎn)品以雅培公司的ID NOW COVID-19 assay為典型代表產(chǎn)品。重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）是Niall A. Armes在2006年創(chuàng)建的一種等溫擴(kuò)增技術(shù)。之后江蘇奇天基因公司利用細(xì)菌或真菌的重組酶替代RPA技術(shù)中T4噬菌體來源的重組酶，構(gòu)建了重組酶介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)（RAA）技術(shù)，并利用該技術(shù)開發(fā)了系列分子診斷產(chǎn)品，目前研發(fā)的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒（熒光RT-RAA法）已獲得國家藥品監(jiān)督管理局第三類醫(yī)療器械注冊證。 

03 數(shù)字PCR技術(shù) 數(shù)字PCR是（Digital PCR，dPCR）是近年來迅速發(fā)展起來的一種高靈敏核酸定量分析技術(shù)，早是在1999年由Vogelstein和Kinzler提出。 基于有限分割原理，dPCR技術(shù)可以根據(jù)反應(yīng)體系中的泊松分布和陽性比例，以“數(shù)字式”計量方式對樣品進(jìn)行定量分析。 根據(jù)液體分散方式，目前dPCR主要有微反應(yīng)室芯片式、集成流路式和微滴式三種主流方式，代表性應(yīng)用平臺分別為ThermoFisher公QuantStudio? 3D芯片dPCR系統(tǒng)，Illumina Ventures的Naica crystal微滴dPCR系統(tǒng)，Bio-Rad公司QX100、QX200和RainDrop系列。 dPCR技術(shù)突破了熒光定量PCR技術(shù)中以檢測熒光信號實(shí)時變化進(jìn)行結(jié)果分析的方式，在檢測過程中無需標(biāo)準(zhǔn)曲線或者參照基因即可對靶標(biāo)核酸進(jìn)行測定和比較。因此在檢測過程中， dPCR技術(shù)結(jié)果定量不依賴于擴(kuò)增曲線循環(huán)Ct值，且不受擴(kuò)增效率的影響，特別在量化差異微小的樣品區(qū)分中性能優(yōu)異 ，目前在病原微生物檢測、基因突變相關(guān)疾病檢測、拷貝數(shù)變異檢測、食品安全檢測、基因表達(dá)分析等方面均得到廣泛的應(yīng)用。

04 分子床旁即時檢驗(yàn) 分子床旁即時檢驗(yàn)（Molecular Point-of-Care Testing，POCT），一般是指基于不同的核酸擴(kuò)增原理，通過整合儀器、檢測試劑和軟件等多種技術(shù)原理設(shè)計的檢測系統(tǒng)，易于小型化或微型化、操作便捷，適合在床旁、病房或中心實(shí)驗(yàn)室之外的其他特定場景（如社區(qū)醫(yī)院、家庭檢測等）開展即時檢測，是目前分子診斷一個重要的發(fā)展方向。 樣本前處理和核酸純化提取一直是分子POCT檢測中的難點(diǎn)，其解決方法一般是通過利用微流控技術(shù)結(jié)合特定物理或化學(xué)方式，將核酸提取純化與擴(kuò)增、檢測集成到一起。目前一些商業(yè)化POCT平臺，如GeneXpert利用小型超聲破碎方式，F(xiàn)ilmArray采用玻璃珠研磨等方式，都可以有效地實(shí)現(xiàn)核酸釋放與進(jìn)一步純化。

但是這些方式對于POCT檢測平臺的系統(tǒng)復(fù)雜性、可制造性與可重復(fù)性等方面帶來相應(yīng)的挑戰(zhàn)。為此一些POCT檢測平臺則采用免核酸提取方式，將樣本利用裂解液直接處理后即用于下一步核酸擴(kuò)增與檢測，如雅培的IDNOW檢測平臺和卡尤迪公司的閃測?Flash20平臺等。 但是同時要注意到，相比于常規(guī)核酸提取純化及濃縮后進(jìn)行的擴(kuò)增檢測方式，這種 免提取直接擴(kuò)增的方式是以降低檢測性能來換取更短檢測時間與更少操作步驟 ，對于病原體核酸載量低的樣本存在更多的漏檢可能。 

05  病原宏基因組高通量測序技術(shù) 宏基因組高通量測序技術(shù)（me[x]tagenomic next-generation sequencing，mNGS）是一種不依賴微生物培養(yǎng)的核酸檢測技術(shù)，其依靠高通量測序平臺和生物信息學(xué)分析流程，可以 在短時間內(nèi)通過一次測試完成批量樣本中全部微生物核酸數(shù)據(jù)的解讀 。隨著檢測流程的逐漸完善和測序成本的快速下降，近年來，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用在包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、血流感染、呼吸系統(tǒng)感染在內(nèi)的各種感染性疾病相關(guān)標(biāo)本的檢測中，為疑難及危急重癥病人的感染診斷提供了病原學(xué)證據(jù)，尤其在鑒定罕見、新發(fā)和混合感染病原體及排除感染方面體現(xiàn)出了較大優(yōu)勢。 

盡管目前還缺乏通用指南和建議以幫助mNGS在診斷實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展，但是來自于急診、重癥、感染及檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的國內(nèi)外專家已經(jīng)組織撰寫并公布了多個mNGS臨床應(yīng)用的專家共識，從實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和人員要求、臨床適用癥、標(biāo)本處理、核酸提取、文庫構(gòu)建和測序、生物信息學(xué)分析和結(jié)果報告、性能確認(rèn)方法、質(zhì)量控制要求等均進(jìn)行了闡釋并提出了建議，這有利于mNGS本地化檢測平臺的的建立及規(guī)范化實(shí)施。 

06   分子診斷技術(shù)在其他熱點(diǎn)診斷領(lǐng)域中的應(yīng)用 近年來，隨著人類基因組計劃的順利實(shí)施，許多與人類健康相關(guān)的基因功能得到了詮釋，除了在病原診斷領(lǐng)域之外，分子診斷技術(shù)在腫瘤診斷、遺傳病診斷以及產(chǎn)前診斷中也得到廣泛應(yīng)用。 長鏈非編碼RNA、腫瘤循環(huán)DNA、外泌體等新型腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，賦予了腫瘤實(shí)驗(yàn)診斷全新的內(nèi)涵， 腫瘤分子診斷已經(jīng)成為分子診斷的重要組成和研究熱點(diǎn) 。多種高精度分子生物學(xué)技術(shù)正在被用于腫瘤相關(guān)診斷，在腫瘤分子分型、個體化治療方案制定、預(yù)后評估中發(fā)揮著日益重要的作用。近期，研究人員結(jié)合微流控芯片通量高與數(shù)字PCR靈敏度高的優(yōu)勢，建立一種基于微流控芯片和數(shù)字PCR的乳腺癌基因HER2的突變檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對HER2突變高通量檢測。針對高通量測序技術(shù)在痕量腫瘤ctDNA檢測靈敏度低的難題，有研究人員研發(fā)了一種基于深度測序腫瘤個體化建檔法（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）的集成數(shù)字誤差抑制增強(qiáng)平臺的新方法，該方法實(shí)現(xiàn)了液體活檢的EGFR分析，檢測非小細(xì)胞肺癌患者ctDNA水平低至0. 004%。 

遺傳性疾病由于病種繁多，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，且多為罕見病，臨床上極易發(fā)生漏診、誤診。 分子診斷技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展極大地改變了疾病的診療模式 ，使遺傳病的診斷與防治困境得以改善。DNA 微陣列芯片突變分析技術(shù)因其固相雜交而具有的并行性和高通量等特點(diǎn)，已被廣泛用于肝豆?fàn)詈俗冃缘呐R床診斷，研究人員已開發(fā)了一種可檢測87 種ATP7B 基因突變的DNA 微陣列芯片，實(shí)現(xiàn)了肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B 基因突變的快速篩查。

小結(jié)與展望

分子診斷技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用在感染性疾病、遺傳病、腫瘤的診斷和治療中發(fā)揮了極其重要的作用，尤其是以等溫擴(kuò)增技術(shù)、dPCR技術(shù)、高通量測序技術(shù)等為代表的新型分子診斷技術(shù)的興起及向臨床中的轉(zhuǎn)化應(yīng)用，極大的彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法在檢測范圍、敏感性、特異性及周轉(zhuǎn)時間等多方面的不足。在未來的發(fā)展方向上，分子診斷技術(shù)將在快速便捷、高靈敏、高準(zhǔn)確性、高度自動化集成化、高通量的方向上持續(xù)優(yōu)化和轉(zhuǎn)化，促進(jìn)臨床疾病的早期診斷和治療。但必須明確的是，當(dāng)這些新興分子診斷技術(shù)不斷被引入用于臨床標(biāo)本的檢測時，臨床實(shí)驗(yàn)室務(wù)必做好內(nèi)部質(zhì)量管理、性能確認(rèn)、臨床溝通和結(jié)果解釋，確保檢測系統(tǒng)適用于擬檢測標(biāo)本的預(yù)期用途，促進(jìn)技術(shù)在臨床應(yīng)用中的有序發(fā)展及合理使用。