肝癌細(xì)胞株HepG2中側(cè)群細(xì)胞的生物學(xué)特性

　　我們從人肝癌細(xì)胞株HepG2中分離出側(cè)群(SP)細(xì)胞,并觀察其生物學(xué)特性,為尋找肝癌干細(xì)胞并證明其與轉(zhuǎn)移歸巢的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).
　　材料和方法 　　
　　1.材料:人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)于復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所),Hoeclzst33342、維拉帕米、碘化丙錠(PI,Sigma公司)、低豁附6孔板、人工基底膜基質(zhì)凝膠(Matrigel,美國(guó)BD公司)、MultiskanFC酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀一BDFACSAriaTMII細(xì)胞分選系統(tǒng).
　　2.細(xì)胞培養(yǎng):HepG2用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基,放人37℃恒溫、5%COZ孵化箱中培養(yǎng).
　　3.分選SP細(xì)胞:重懸細(xì)胞于預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基中,濃度為1x109/L,加人Hoechst至終質(zhì)量濃度為5m留L,370C,90min孵育,對(duì)照組在Hoechst染色前加人終質(zhì)量濃度為50m擴(kuò)L的維拉帕米.孵育結(jié)束后重懸細(xì)胞于冰的Hanks平衡鹽,同時(shí)加人2m剔LPI以區(qū)分壞死細(xì)胞,后FAGS分析.下面所有實(shí)驗(yàn)都以經(jīng)流式細(xì)胞儀分選出的SP細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組選取同代未經(jīng)分選的HepG2細(xì)胞.
　　4.非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SLID)鼠接種實(shí)驗(yàn):雄性NOD/SCID鼠(5周)每組各5只.經(jīng)分選所得SP細(xì)胞調(diào)整濃度至2x10'/L.對(duì)照組HepG2細(xì)胞調(diào)整濃度至2x106/L.分別將前述細(xì)胞懸液0.2ml注射于小鼠皮下,觀察成瘤情況.90d后處死小鼠,取皮下形成的腫瘤,比較其成瘤情況.
　　5.細(xì)胞外基質(zhì)載附實(shí)驗(yàn):分別將100閃SP細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞懸液接種于包被牛血清白蛋白(BSA),Matrigel的96孔板中,37℃培養(yǎng)1h,按嘎哇藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定各孔細(xì)胞的吸光度(A)值,以對(duì)照基底膜BMA組貼壁細(xì)胞A值為參照,按公式計(jì)算Matrigel組細(xì)胞茹附率,每組平行6個(gè)樣本.
　　6.Tranawell侵襲實(shí)驗(yàn):Transwell上室加人200p,1細(xì)抱懸液,下室加人500閃條件培養(yǎng)基.37℃,24h舌顯微鏡下觀察.計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù),取5(上、下、左、右、中)個(gè)視野(x200),記錄每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù),計(jì)算均值;每組細(xì)胞設(shè)定6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組;7.遷移實(shí)驗(yàn):方法類似上述侵襲實(shí)驗(yàn),但Transwell上室未加人Matrigel人工基底膜.
　　8.成球培養(yǎng):配制添加表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF),B27,LIF,LG和肝素的DMEMF12培養(yǎng)基〔’〕,用配制好的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸,加人低茹附的6孔板中,?？准尤?000個(gè)細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組各6孔,Sd后計(jì)數(shù)成細(xì)胞球個(gè)數(shù)9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn).
　　結(jié)果
　　1.人肝癌細(xì)胞株HepG2存在SP細(xì)胞:經(jīng)細(xì)胞核燃料Hoechst33342染色后,用BDFACSAriaT"tII流式細(xì)胞儀進(jìn)行SP細(xì)胞檢測(cè),檢測(cè)組可以看到2群細(xì)胞,位于左下角的側(cè)群細(xì)胞呈鳥(niǎo)嘴狀,經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)得約占0.9%.對(duì)照組加人不同劑量的維拉帕米后,這群細(xì)胞消失.
　　2.NOD/SLID接種成瘤實(shí)驗(yàn):SP細(xì)胞接種成瘤實(shí)驗(yàn)顯示2x104個(gè)SP細(xì)胞即可成瘤,而對(duì)照組接種2x10"個(gè)都未能形成腫瘤.移植瘤切取行常規(guī)病理切片檢查證實(shí)為肝細(xì)胞癌.
　　3.細(xì)胞外基質(zhì)茹附實(shí)驗(yàn):SP細(xì)胞的勃附率為(16.19士3.68)%,對(duì)照組細(xì)胞豁附率為(25.O1士13.97)%,經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.36,P>0.OS).
　　

　　4.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn):SP細(xì)胞穿出數(shù)為(2014)個(gè),對(duì)照組細(xì)胞穿出數(shù)為(16土3)個(gè),兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.462,P>0.OS,圖lA,1B).
　　5.遷移實(shí)驗(yàn):24h后SP細(xì)胞穿出的細(xì)胞數(shù)為(8}士to)個(gè),對(duì)照組穿出的細(xì)胞數(shù)為(4}18)個(gè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.646,P<0.05,圖1C,1D).
　　6.成球培養(yǎng):利用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng),Sd后觀察,細(xì)胞可形成連接緊密的細(xì)胞球,每個(gè)球由25一50個(gè)細(xì)胞組成.鏡下計(jì)數(shù)兩組細(xì)胞成球的數(shù)量,實(shí)驗(yàn)組SP細(xì)胞形成細(xì)胞球的數(shù)量為(5419)個(gè),對(duì)照組細(xì)胞形成細(xì)胞球的數(shù)量為(1813)個(gè),兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.632,P<0.OS).
　　討論
　　SP細(xì)胞是一群具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞,研究表明包括胃癌、肝癌等消化道惡性腫瘤中存在SP細(xì)胞iz=},并且分選出的SP細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物.
　　本研究結(jié)果顯示,利用人肝癌細(xì)胞株HepG2經(jīng)流式分選可以得到SP細(xì)胞,但比例較低(約1%),這與腫瘤干細(xì)胞理論相符,加人維拉帕米后這群細(xì)胞消失,證實(shí)這群細(xì)胞是SP細(xì)胞.隨后在接種NOD/SLID鼠成瘤_實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn)SP細(xì)胞比對(duì)照組細(xì)胞有更強(qiáng)的成瘤能力,進(jìn)一步研究結(jié)果顯示利用含肝素?zé)o血清懸浮成球培養(yǎng)法培養(yǎng)的SP細(xì)胞在相同時(shí)間內(nèi)可以形成更多的細(xì)胞球,提示在分選出的SP細(xì)胞中富集了大量肝癌干細(xì)胞,并且干細(xì)胞可能在腫瘤形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用.
　　侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SP細(xì)胞在體外侵襲能力與對(duì)照組細(xì)胞比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能的解釋是肝癌微環(huán)境還存在各種細(xì)胞因子(如趨化因子)和細(xì)胞表面分子,新研究還提示腫瘤干細(xì)胞在侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT-)現(xiàn)象關(guān)系密切.而分選出的SP細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力,提示SP細(xì)胞中所富集的肝癌干細(xì)胞具有較強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力.
　　總之,本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并分選出肝癌細(xì)胞株HepG2中的SP細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性,表明HepG2中的SP細(xì)胞可能富集了肝癌干細(xì)胞.
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