高爾基磷酸化蛋白3在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

　　哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是細(xì)胞內(nèi)磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/mTOR信號(hào)通路的中心調(diào)控點(diǎn)，與腫瘤細(xì)胞分裂生長(zhǎng)和增殖相關(guān)，近研究結(jié)果顯示高爾基磷酸化蛋白3(GOLPH3)通過激活mTOR，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，是一種新的癌基因，且備受關(guān)注〕有關(guān)GOLPH3與結(jié)直腸癌組織的關(guān)系研究報(bào)道尚少。我們通過Westernblot等方法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中GOLPH3的表達(dá)，探討其與臨床病理因素、mTOR和癌細(xì)胞增殖之間的關(guān)系。 　　

　　材料與方法 　　

　　1一般資料:2012年2月至2012年7月62例結(jié)直腸癌患者于福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院接受手術(shù)治療，術(shù)前均無化療或放療;年齡18一84歲，平均60.66歲;其中男38例，女24例。腫瘤部位:右半結(jié)腸11例，左半結(jié)腸12例，直腸39例;采用第7版AJCC/UICC結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)，其中I期5例，II期27例，IQ期30例，腫瘤細(xì)胞組織學(xué):高、中分化腺癌51例，低分化腺癌或薪液腺癌11例。切取正常結(jié)直腸就膜(距腫瘤邊緣10cm以上)作為對(duì)照組抗GOLPH3抗體、第二抗體、內(nèi)參抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自Abcam公司。 　　

　　2.Westernblot法檢測(cè):用二峰琳甲酸(BCA)蛋自定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，10%十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)膜，TBST+5%脫脂奶粉封閉，加人抗GOLPH3抗體，洗膜后加人二抗，洗膜后加人免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)，顯影、洗片。Westernblot結(jié)果均經(jīng)過多次重復(fù)，用凝膠圖像分析儀掃描照片。用Image-.1圖像處理系統(tǒng)測(cè)定圖片上每個(gè)特異條帶灰度值。每個(gè)標(biāo)本GOLPH3與內(nèi)參GAPDH的條帶灰度值的比值，作為GO1}PH3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶(SP)法根據(jù)抗體試劑盒說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。 　　

　　3.mTOR染色的判斷標(biāo)準(zhǔn):每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡(x400)視野。陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%一24%為1分，25%一49%為2分，50%一74%為3分，,75%為4分。陽性細(xì)胞表達(dá)的著色深度:基木不著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色3分。 　　

　　兩者得分相乘，,1分的病例判定為表達(dá)陰性，其余的病例判定為表達(dá)陽性。 　　

　　4.細(xì)胞核增殖抗原(Ki-67)增殖指數(shù):隨機(jī)選擇至少5個(gè)高倍鏡(x400)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)，即為Ki-67增殖指數(shù)。 　　

　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用t檢驗(yàn)和方差分析(One-wayANOVA),GOLPH3表達(dá)與Ki-67增殖指數(shù)的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。 　　
　　結(jié)果
　　1.結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸載膜的GOLPH3表達(dá):結(jié)直腸癌組織中GOI,PH3蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.76土0.59，明顯高于正常乳膜GOLPH3蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.61士0.53,P<0.05，圖1)。 　　

　　2.結(jié)直腸癌組織GOLPH3表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系(表1):本組結(jié)直腸癌組織中GOLPH3的表達(dá)與細(xì)胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期明顯相關(guān)，在細(xì)胞分化差、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中GOLPH3的表達(dá)量明顯高于高、中分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織(P<0.05),III期的結(jié)直腸癌組織中GOLPH3的相對(duì)表達(dá)量明顯高于I一II期的結(jié)直腸癌(P<0.05)，而其他因素如年齡、性別、腫瘤位置、大體類型、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度和血癌胚抗原(CEA)水平，結(jié)直腸癌組織中GOLPH3的相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 　　

　　3.結(jié)直腸癌組織GOL.PH3表達(dá)與mTOR表達(dá)、Ki-67增殖指數(shù)的關(guān)系:mTOR陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀，本組病例mTOR的陽性表達(dá)率為53.2%,mTOR陽性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織中GOLPH3的相對(duì)表達(dá)量明顯高于mTOR陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織(P<0.05)，見表1oKi-67陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒狀，采用Pearson相關(guān)分析，結(jié)直腸癌組織中GOLPH3的相對(duì)表達(dá)量(0.76士0.5})與Ki-67增殖指數(shù)(0.46士0.17)呈正相關(guān)(r=0.325,p<0.05}。 　　

　　討論
　　GOLPH3基因也稱為GPP34,編碼1種34000的蛋白質(zhì)，是高爾基體復(fù)合物的一種相關(guān)蛋白，主要發(fā)揮蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。近來研究表明GOLPH3基因的擴(kuò)增是導(dǎo)致結(jié)直腸癌等多種實(shí)體癌Sp13上的基因大量擴(kuò)增的原因之一，且可促進(jìn)人類癌細(xì)胞增殖，可能是一種原癌基因i}3]。因此，我們采用Westernblot等方法探索結(jié)直腸癌組織中(;OLPH3蛋白質(zhì)表達(dá)及其與癌細(xì)胞增殖的關(guān)系。 　　

　　本研究結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組織中GOLPH3存在過表達(dá)，與結(jié)直腸癌的惡性程度相關(guān)。在食管癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤等多種組織中存在GOLPH3的過表達(dá)，與低分化、臨床分期、預(yù)后差相關(guān)，支持GOLPH3是1個(gè)原癌基因fa-}i，推測(cè)GOLPH3在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 　　

　　GOLPH3的過表達(dá)可調(diào)節(jié)高爾基體的蛋白質(zhì)糖基化轉(zhuǎn)移酶的定位而影響腫瘤相關(guān)蛋白的糖基化修飾川，通過控制核2乙酞氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶1(C2GnTl)在高爾基體的停留和影響豁附分子I(ICAM-I介導(dǎo)的E一選擇素活化而降低細(xì)胞間的載附[gj，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。 　　

　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組織中GOLPH3的過表達(dá)與mTOR表達(dá)、細(xì)胞增殖指數(shù)正相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5j。GOLPH3過表達(dá)可增強(qiáng)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)引起的核蛋白S6激酶(S6K)表達(dá)水平升高，同時(shí)可通過絲氨酸473(Ser4730磷酸化激活A(yù)KT，刺激mTOR信號(hào)通路，加速細(xì)胞分裂}31，而封閉GOLI'H3基因表達(dá)可明顯減少乳腺癌或橫紋肌肉瘤細(xì)胞的增殖`~5'io},GOLPH3還可通過與Retromer復(fù)合體中Vps35作用，調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路的活性促進(jìn)增殖fs}al這些研究結(jié)果表明GOI,PH3是mTOR信號(hào)通路中的癌基因，有可能為結(jié)直腸癌的靶向治療提供新的策略。 　　

　　本研究結(jié)果表明，GOLPH3在結(jié)直腸癌組織中存在過表達(dá)，與細(xì)胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和irirOR表達(dá)相關(guān)，可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。 　　

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