視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白-6在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其意義

　　結(jié)腸癌目前為有效的治療措施為手術(shù)切除，腫瘤復(fù)發(fā)是導(dǎo)致結(jié)腸癌患者術(shù)后治愈率下降的主要原因，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，且一部分患者死亡率也隨之升高。因此，發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用新的預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)的因子對(duì)實(shí)施個(gè)體化、導(dǎo)向性的治療尤為重要。新發(fā)現(xiàn)的癌基因視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白一6(RBBP6)在肺癌·和食管癌中高表達(dá)，但卻缺少其在結(jié)腸癌中表達(dá)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察RBBP6基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)，探討其對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的意義。 　　
　　材料與方法 　　
　　1.一般資料:40例結(jié)腸癌患者中女23例(57.5%)，男17例(42.5%);年齡(68.45土10.47)歲。所有標(biāo)本均為上海交通大學(xué)附屬上海市人民醫(yī)院普外科惡性腫瘤患者的手術(shù)切除標(biāo)本。經(jīng)病理確診為結(jié)腸癌。其中I期患者5例(12.5%),II期患者15例(37.5%)，111期患者17例(42.5%),1}1期患者3例(7.50}o);細(xì)胞分化較好12例(30%)，分化一般的19例(47.5%)，分化較差的9例(22.5%;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8例(20%)，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的32例(80%0)所有病例均達(dá)到肉眼下，并行術(shù)野的淋巴結(jié)清掃。 　　
　　術(shù)后切下標(biāo)本后，即刻于腫瘤及瘤外5cm以上區(qū)域(作為無(wú)瘤組織)分別切取1塊1c而左右大小組織塊，立即置人一196℃液氮中保存。所有病例術(shù)前均未行放、化療等抗腫瘤治療。將所有病例按年齡、性別、腫瘤分布、大小、分期、分化、淋巴結(jié)有否轉(zhuǎn)移等進(jìn)行分組二以實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timePCR)法檢測(cè)RBBP6在腫瘤組織和正常組織(癌旁無(wú)瘤組織)中的表達(dá)。RNeasyProtectMini試劑盒(德國(guó)(}ia-ben公司)用于RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(2uantiTect.
　　ReverseTransc[x]ription(美國(guó)Fermenta、公司)，PCR試劑盒MaximaSYBRGreenc1PCRMasterMixes(美國(guó)Fer_mentas公司)。免疫組織化學(xué)抗體:鼠抗人RBBP6單克隆抗體(ab55787，美國(guó)Abeam公司)，即用型二抗GTvision抗鼠/兔通用型(基因科技G1}500705)儀器:勻漿器，F(xiàn)ppendorf熒光定量PCR儀，凝膠顯影儀。 　　

　　2.RNA提取:每30mg組織加人600plRTL試劑，在勻漿器中將組織塊磨成勻漿，使樣品充分裂解，移人離心管。將離心管在4℃,12000r/min，離心10min，吸出_[清，加人另一離心管中，同時(shí)加人等體積的70%乙醇，用吸管混勻。吸取700閃的樣品加人附有RNeasy吸附柱的2ml收集管中，40C,12000r/mir，離心1min,棄廢液。加人700閃R}}1緩沖液至吸附柱，40C,12000r/min再次離心1min，沖洗吸附柱，棄廢液。加人500p,1RPE試劑至吸附柱，40C,12000r/min離心1min，棄廢液。重復(fù)上一步驟2次。轉(zhuǎn)移吸附柱至新的2ml離心管，離心再將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的1.5ml收集管中，加人30一50閃的無(wú)核糖核酸酶水，洗脫吸附柱土的RNA,40C,12000r/min離心2miry，收集管中即得提取的RNA。用紫外分光光度討一檢測(cè)RNA在260nm處的吸光度(A)值，A二20m郭L。根據(jù)在260nm和280nm處的A值，檢測(cè)RNA的純度。 　　

　　3.cDNA合成及Real-timePCR:通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以O(shè)ligo(dT)15為引物，由totalRNA的3'Poly(A)區(qū)域引導(dǎo)出eDNA，而后以eDNA產(chǎn)物為模版，設(shè)計(jì)并合成PCR引物(表1)，在Eppendorf高通量熒光定量PCR儀進(jìn)行Real-timePCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件:500C2min,950C10min，95℃15s，600C30s，720C30s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min。測(cè)得RBBP6和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDR)的表達(dá)。反應(yīng)完成后，取部分反應(yīng)液點(diǎn)于1.8%瓊脂糖凝膠中，70V電泳。 　　

　　4.Real-timePCR結(jié)果校正:40對(duì)樣品量均為1閃，然而由于受RNA濃度的定量誤差和P1NA轉(zhuǎn)錄效率誤差等影響，每個(gè)樣品1閃體積中的eDN,A含量并不相同，為校正此差異，木研究使用管家基因GAPDH作為內(nèi)參，以樣品待測(cè)基因值與此樣品內(nèi)參值經(jīng)公式換算后即得2-}}c:}:RBBp6L1Ct=(Avg.RBBP6_Ct一Avg.CF'DH_Ct)，RBBP6}OCt=(RRBP60Ct_tumor-RBBP6'Ci_non-tumor)。 　　

　　5.免疫組織化學(xué)法:將存檔的72對(duì)石蠟標(biāo)本重新制備厚4htm切片，脫蠟，再水化。置于pH6.0的檸檬酸緩沖液中行高壓抗原修復(fù)后，3aloHzOz封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性~滴力[}IRRBP6一抗，4℃冰箱濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。滴加二抗，并置于37℃恒溫箱內(nèi)孵育30rain一顯微鏡下二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，脫水至透明，中性樹膠封片。用已知結(jié)腸癌切片作為對(duì)照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定:由2位不知曉患者臨床資料的病理醫(yī)師進(jìn)行結(jié)果判定。以胞核內(nèi)有黃或棕黃色顆粒染色者為RBBP6陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞占百分比<10%記為陰性，10%一50%者為弱陽(yáng)性，>50%者為強(qiáng)陽(yáng)性、

　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)一中多組之間采用廠檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)結(jié)果
　　1.RNA抽提質(zhì)量鑒定:經(jīng)鑒定，終所有樣本RNA在丸wAzs。的比值均在1.8一2.0，表明提取的RNA無(wú)降解及蛋白質(zhì)污染。 　　

　　2.Real-timePCR檢測(cè)40對(duì)樣本RBBP6mRNA的表達(dá):腫瘤組織中RBRP6mRNA的表達(dá)平均值為4.88，遠(yuǎn)高于正常結(jié)腸組織(距病灶5cm以上無(wú)癌瘤處組織)中RRBP6mRNA的表達(dá)平均值(3.49,P<0.01)。進(jìn)一步比較RBBP6mRNA在腫瘤組織中的表達(dá)，可見RBBP6mRNA的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)(P>0.05);而在結(jié)腸癌不同分期類型}}}}I期和11期RBBP6mRNA的表達(dá)量為4.31士0.74,}和W表達(dá)量為5.45士1.49，可見分期越晚，RBBP6mRNA表達(dá)越高(P<0.05)。并且RBBP6mRNA的表達(dá)在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移者為5.07士1.37，高于淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移者4.42士0.68P<0.05)。部分特異性PLR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示正常組織和腫瘤組織cDNA量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腫瘤組擴(kuò)增量顯著增加(P<0.05，圖1)。 　　

　　3.RBBP6表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系:結(jié)果見表2_RBBP6的表達(dá)量與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P<0.01)、腫瘤分期(I'<0.01)和分化(P<0.05)高度相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)(P>0.05)072例結(jié)腸癌腫瘤組織中RBBP6陰性者23例，弱陽(yáng)性者32例，強(qiáng)陽(yáng)性者17例。免疫組織化學(xué)染色顯示RBBP6在正常組織無(wú)表達(dá)或弱表達(dá)6.9%(5/72)，在腫瘤組織中高表達(dá)68.1%(49/72)，與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致(圖2).
　　討論
　　基因RBBP6位于16p11.2一p12，編碼200000的蛋白。RBBP6是1種核蛋白，其N端有鋅指結(jié)構(gòu)域，可通過(guò)人雙微體蛋白2(HDl}Z2)降解p53，提示其有E4樣泛素化樣活性!SJ我們應(yīng)用結(jié)腸癌新鮮冰凍標(biāo)本檢測(cè)F}BBP6mRNA表達(dá)水平，可見其在腫瘤組織的mRNA水平顯著高于正常結(jié)腸組織(4.88比3.49)進(jìn)一步免疫組織化學(xué)顯示68.1%(49/72)的結(jié)腸癌組織表達(dá)RBBP6，正常組織中只有6.9%(5/72)這些結(jié)果提示RBBP6在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平都是高表達(dá)。進(jìn)一步分析顯示RBBP6的表達(dá)量與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和分化高度相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)。它提示RBBP6高表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。在結(jié)腸癌不同分期類型中，I期和11期RBBP6mRNA的表達(dá)值為4.31士0.74,III期和IV期表達(dá)值為5.4511.49，可見分期越晚，RBBP6mRNA表達(dá)越高，提示其有促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)展的作用。結(jié)合免疫組織化學(xué)、PCR的結(jié)果以及聯(lián)合臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果，提TRBBP6可作為結(jié)腸癌診斷及判斷預(yù)后的新指標(biāo)二RBBP6在肺癌中高表達(dá)，在肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染p53siRNA會(huì)增加RBBP6ruRNA的表達(dá)。轉(zhuǎn)染RBBP6siRNA會(huì)提高bax/B細(xì)胞淋巴瘤/自血病一2(bcl-2mRNA的表達(dá)，提示RRBP6有抑制肺癌細(xì)胞凋亡的作用P3}在食管癌的研究中也現(xiàn)RBBI'6高表達(dá)川RBBP6已被證實(shí)可與抑癌基因p53'}6〕和Rb}'}結(jié)合，有抑制p53結(jié)合DNAr一以及抑制腺病毒一早期基因(ElA)結(jié)合Rb}-w}的功能，提示其有促腫瘤形成的作用。RBBP6過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，提示其有抑制細(xì)胞正常生長(zhǎng)的功能。 　　
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