血管內(nèi)皮生長因子及其受體各亞型在心肌梗死大鼠體內(nèi)的差異性表達

　　心肌梗死(myocardialinfarction,MI)是由冠狀動脈粥樣硬化冠狀動脈的栓塞，使一部分心肌缺少血液而壞死的疾病。心肌細胞的修復(fù)反應(yīng)將會在相應(yīng)位點發(fā)生，以保證心臟結(jié)構(gòu)的完整性和心臟功能的恢復(fù)。血管生成、炎癥和成纖維反應(yīng)是心肌修復(fù)的關(guān)鍵反應(yīng)。近的研究證實新生成的血管首先生成在交界區(qū)(發(fā)生梗死和未發(fā)生梗死的心肌層之間)，然后由此向，自肌梗死的區(qū)域延伸。已有研究發(fā)現(xiàn)有許多細胞因子參與調(diào)節(jié)血管生成，包括轉(zhuǎn)化生長因子、成纖維細胞生長因子和血小板衍生生長因子等〔3<+1:血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族在血管再生和淋巴管再生中起到關(guān)鍵作用，在胚胎發(fā)育中能夠促進新血管生成，而在創(chuàng)后的心臟中能夠通過誘生側(cè)枝血管來緩解血管阻塞x.5-6。VEGF家族主要有5種亞型:VEGF-A,B,C,D和胎盤生長因子。VEGF主要是通過細胞表面的酪氨酸激酶受體產(chǎn)生作用，VEGF的受體主要有3種:VEGFR-i(Flt-1),VEGFR-2(IkDR/Flk-1)和VEGFR-3(Flt-4)二其中VEGF-A主要與VEGFR-1和VEGFR-2結(jié)合;VEGF-B與VEGFR-1結(jié)合;VEGF-C和VEGF-D主要與VEGFR-2和VEGFR-3結(jié)合。VEGF家族的各個亞型在心肌梗死中的血管再生過程中所起的作用并不清楚，筆者在2011年10月至2012年4月在中國科學(xué)院上海實驗動物中心探究VEGF家族各亞型及其受體在發(fā)生梗死的心臟中的表達情況，同時確定VEGF在心肌修復(fù)和重構(gòu)過程中所起的作用。 　　

　　1材料與方法 　　

　　1.1動物模型96只8周齡雄性SDSPF清潔級大鼠進人實驗，其體重為(25士15)g。將所有大鼠編號為1一96號，利用EXCEL隨機函數(shù)=RA1D，生成編號對應(yīng)的隨機數(shù)，再將隨機數(shù)按升序排列，前48只作為實驗組，后48只作為對照組，飼養(yǎng)1周后按下述方法構(gòu)建MI動物模型。實驗動物由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供，實驗操作在中國科學(xué)院上海實驗動物中心進行。其動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)20110004，使用許可證號:SYXK(滬)20110011。清潔級飼養(yǎng)，室溫20一25℃，相對濕度40%-70%，每日12小時光照維持，晝夜循環(huán)，自由進水進食。SD大鼠用1.5%的異氟烷麻醉，人工呼吸手術(shù)左側(cè)開胸，使用絲線結(jié)扎冠狀動脈左前降支，然后縫合胸腔。假手術(shù)組作為對照組(CTL組)。分別在建模的第1,3,7,14,28和42天將心梗大鼠處死(每一時間段組8只大鼠)，取出心臟保存在一80℃?zhèn)溆谩?　　

　　1.2WesternBlot使用免疫蛋白印跡法測定 　　

　　VEGF-A,B,C,D和VEGFR-1,2,3的蛋白表達水平。取心臟冰凍組織(2mmxlmmxlmm)、裂解液(50mmol/LTris，150mmol/LNaCI，1%TritonX100,100郭mlPMSF)、玻璃勻漿器制備勻漿。在勻漿液中加等體積的2倍樣品緩沖液(0.125mol/LTris,4%SDS,2%(3-琉基乙醇,20%甘油，0.2%嗅酚藍，pH6.8)。樣品煮沸3min,10000gx10min離心(40C)，取上清。用紫外分光光度計測量蛋白濃度，確定含50},g總蛋白的上樣量。過程按照美國Bio-Bac公司的操作手冊進行。電轉(zhuǎn)后的PVDF膜室溫封閉后加特異性一抗與HRP標記二抗，混合化學(xué)發(fā)光試劑兩組份底物(1:2)混合ProteinDetectorLumiGLCWesternBlottingKit加至膜上1min，后膠片曝光顯影(10min)}PVDF膜經(jīng)洗脫液(62.5mmol/LTris,20%SDS,100mmol/L日一琉基乙醇)。GAPDH單抗(1:5000)電泳做內(nèi)參照。結(jié)果掃描人電腦并經(jīng)圖像分析軟件處理，得出相對光密度值。 　　

　　1.3統(tǒng)計學(xué)處理RT-PCR和Western的數(shù)據(jù)都使用方差分析，數(shù)據(jù)采用x士￡表達形式，p<0.O5為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 　　

　　2結(jié)果
　　2.1心臟內(nèi)VEGF-A,B,C,D的蛋白表達水平根據(jù)-esternBlot結(jié)果顯示，對照組內(nèi)VEGF-A,B,C,D都有一定程度的表達。在M工大鼠心臟內(nèi)，VEGF-A,B的蛋白水平一直處于下降狀態(tài)，而VEGF-C和VEGF-D在第1天出現(xiàn)降低，在第3天后再升高，并且一直維持在增強狀態(tài)(圖1)。在42d的觀察期內(nèi)，VEGF-A164(18kDa)、VEGF-A188(22kDa)和VEGF-B的蛋白水平全部下降。VEGF-C和VEGF-D的表達在心肌梗死發(fā)生后先是受到抑制，在第3一42天出現(xiàn)顯著升高。 　　

　　2.2心內(nèi)VEGFR-1,2,3蛋白表達水平VEGFR-1的蛋白水平在1一42d內(nèi)都是處于下降狀態(tài);VEG-FR-2的表達明顯被抑制，但在心梗的后期階段逐漸回復(fù)到正常水平;VEGFR-3第1天下降，第3天的時候才開始回升，到第7天達到峰值，隨后開始下降，但心肌梗死組的VEGFR-3一直高于對照組(圖2)。和對照組相比，VEGFR-1和VEGFR-2保持不變或者下降，而VEGFR-3在第1天顯著下降后急速上升，并且在觀察期內(nèi)一直保持在高水平。 　　

　　3討論
　　本實驗中筆者研究了VEGF家族各個亞型及其受體在發(fā)生梗死的大鼠心臟內(nèi)的表達，并且探索了VEGF在心肌細胞修復(fù)和重構(gòu)過程中所起的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，在正常大鼠的心臟血管內(nèi)，VEGF家族各個亞型及其受體都有正常表達，表明VEGF是參與維持正常血管的生長和功能的生長因子。在和對照組比較可以看出，VEGF各亞型及其受體在梗死的心臟內(nèi)存在差異性表達。VEGF-A是迄今為止研究廣泛的亞型，在大鼠體內(nèi)VEGF-A包含3個亞單位(VEGF120,VEGF164和VEGF188，是由于mRNA的選擇性剪切而產(chǎn)生，本實驗結(jié)果證明，在發(fā)生梗死的心內(nèi)，VEGF-A164(18kDaj和VEGFI88(22kDa)的表達顯著下降。 　　

　　VEGF-A的調(diào)節(jié)作用是通過激活VEGFR-1和VEGFR-2來實現(xiàn)的，VEGFR-2兒乎能參與調(diào)節(jié)大部分的細胞應(yīng)答反應(yīng)。VEGFR-1的功能目前沒有定論，但普遍認為它能調(diào)節(jié)VEGFR-2的信號傳導(dǎo)C本實驗顯示在梗死的大鼠心臟內(nèi)VEGFR-1和VEG-FR-2保持不變或是下降，說明}EGF-A可能是啟動心內(nèi)血管生成反應(yīng)的關(guān)鍵因子，但它可能不是血管生成過程的必需因子VEGF-在病理條件下的作用的研究主要集中在腫瘤方面VEGF-能夠激活血管內(nèi)皮細胞生長，被認為是促進腫瘤組織增殖和擴散的首要因子，但VEGF-B在病理條件下的作用主要局限于維持新生血管生長。盡管目前對于VEGF的差異性表達的作用尚不了解，但已經(jīng)證實VEGF-B和VEGF-C的降低有利于血管的再生反應(yīng)。VEGF-C是通過激活VEGFR-2和VEGFR-3而產(chǎn)生作用，本實驗發(fā)現(xiàn)VEGF-C的蛋白表達顯著增加，與此相對應(yīng)的VEGFR-3表達量也上升，證明VEGF-C是參與心梗后血管再生過程的生長因子。 　　

　　也有報道VEGF-D具有激活淋巴管再生和血管生成的作用，VEGF-D通常由多個組織器官分泌，包括心臟、肺、骨骼肌和小腸〔9」。本實驗發(fā)現(xiàn)心梗大鼠的心內(nèi)VEGF-D的mRNA水平和蛋白水平都出現(xiàn)顯著增加，這點和VEGFR-3表達增強相一致。證明了VEGF-D參與了心梗大鼠的血管再生過程。 　　

　　總之，本研究證實了VEGF-A在大鼠心梗早期表達顯著增加，說明VEGF-}可能是啟動血管再生反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。VEGF-C,VEGF-D和VEG-FR-3的表達都出現(xiàn)上調(diào)，其中VEGFR-3主要表達在血管中，說明VEGF-D也是參與血管再生的重要因子，而VEGF-B的表達降低，說明VEGF-B并不是心肌修復(fù)和重構(gòu)的關(guān)鍵因子。但對于VEGF-C,D在心肌修復(fù)中的特異性作用仍需要進一步的研究。 　　

　　參考文獻 　　

　　Zhao T,Zhao W,Chen Y. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-A:roleon cardiac angiogenesis following myocardial infarction[J].Microvascular Research,2010,(02):188-194.
　　Zhao W,Zhao T,Chen Y. Reactive oxygen species promote angiogenesis inthe infarcted rat heart[J].International Journal of Experimental Pathology,2009,(06):621-629.
　　Nah DY,Rhee MY. The inflammatory response and cardiac repair after myocardialinfarction[J].Korean Circ J,2009,(01):393-398.
　　Zhao T,Zhao W,Chen Y. Acidic and basic flbroblast growth factors involvedin cardiac angiogenesis following infarction[J].International Journal of Cardiology,2011,(03):307-313.
　　Yamazaki Y,Morita T. Molecular and functional diversity of vascular endothelialgrowth factors[J].Molecular Diversity,2006.515-527.
　　Holmes K,Roberts OL,Thomas AM,Cross MJ. Vascular endothelial growth factorreceptor-2:structure,function,intracellular signalling and therapeutic inhibition[J].Cellular Signalling,2007,(10):2003-2012.doi:10.1016/j.cellsig.2007.05.013.
　　Connolly DT,Heuvelman DM,Nelson R. Tumor vascular permeability factorstimulates endothelial cell growth and angiogenesis[J].Journal of Clinical Investigation,1989,(05):1470-1478.