終末期腎病維持性血透患者樹突狀細(xì)胞分化成熟能力的研究

        終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)是各種原因?qū)е履I功能下降，需依靠腎臟樸代治療(包括血液透析、腹膜透析和腎移植)維持生命的腎臟疾病的統(tǒng)稱。有研究表明，隨著ESRD患者人數(shù)的逐漸增 多，其社會醫(yī)療成本已經(jīng)超越癌癥[1]。而感染是目前ESRD患者常見的并發(fā)癥和死亡原因之一，是僅次于心腦血管疾病的導(dǎo)致透析患者死亡的第二殺手[1]。近年研究提示免疫功能低下可能是導(dǎo)致ESRD 患者感染高發(fā)生率的重要原因，但其病理生理及分子機(jī)制尚不清楚[2]。眾所周知，樹突狀細(xì)胞(dendritic cell , DC)在感染的固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，本研究擬通過體外實驗檢測ESRD患者DC分化成熟能力及其功能的改變，以期初步闡明 DC與ESRD患者免疫功能低下的關(guān)系。
 

       1對象與方法 
       1.1主要試劑和儀器 人淋巴細(xì)胞分離液、BPIV'II1640細(xì)胞培養(yǎng)液(Biowest, 法國);重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granu- locyte macrophage colony stimulating factor，G l}T一CSF) 和重組人白介素4 (interleakiu-4 , IL-4 ) ( Peprotech，美國);脂多糖(lipopolvsaccharide，LPS)(Sigma一aldrieh，美國);Human IL-12p70 EI.ASA試劑盒( Bender NTedsvstem ,奧地利);抗CD40-FI'I'C抗體、抗CD80- FTTC抗體、抗C C R7 -FITC打L體、抗C D83 -PE抗體、抗 C D86-PE抗體、抗HT.A-DR-PE抗體(eBioscience，美國);低溫離心機(jī)和FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(HD, 美國);酶標(biāo)儀(Thereto，芬蘭)。 
       1.2對象和分組
 

       1.2.1 ESRD組隨機(jī)選取20例在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科一接受門診維持性血液透析治療的ESPrD患者，其中男性12例，女性 8例;平均年齡(65. 2士11.4)歲;每周透析2一3次，每次透析)4h，同時子以常規(guī)降壓藥物、促紅細(xì)胞生成素(ervthropoietin, EPO)、活性維生索D等輔助治療二、透析治療前血清肌配平均為(734. 80 1 126. I S ) 林mol/L，透析前血尿素氮平均為(18.%士5. 91 ) mmol/ L.所有研究對象對相關(guān)研究知情同意。 1.2.2止常對照組隨機(jī)選取健康志愿者20名，其中男性10名，女性10名，平均年齡(60.6110.8) 歲依據(jù)1TDRD校正公式估算腎小球濾過率(esti- mated glomerular filtration rate，eGFR)>90 mL/(min· 1. 73 m2 )，無長期服用藥物史。血清肌醉平均為 (75. 80士10. 33 )林mol/1，血尿素氮平均為(5. 22士 0. 60 ) mmol/L。所有人選對象劉一相關(guān)研究知情同意。 入選者對一相關(guān)研究知情同意。 1.2.3排除標(biāo)準(zhǔn)自身免疫性疾病和腫瘤性疾病; 乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒等傳染性疾病;近 1個月內(nèi)有嚴(yán)重感染史或長時間使用抗生素治療;近 6個月內(nèi)囚各種原因使用激素和(或)免疫抑制劑治療;近6個月內(nèi)有活動性出血史或輸血史。 
      

        1.3方法

       1.3.1樣本采集和處理ESRD組于透析前靜脈端采血，正常對照組則采集空腹靜脈血，每例取抗凝血 15 m L ;密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞，經(jīng)貼壁培養(yǎng)2h去除淋巴細(xì)胞，分離出單核細(xì)胞，每皿加人 5 mL RPM11640細(xì)胞培養(yǎng)液.同時一加人重組人GM- CSF',重組人IL-4各50以，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng); 培養(yǎng)第3天，子以細(xì)胞換液.每皿加入相同劑rt的 RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液、重組人GVl-CSF和重組人 II,-4 ;培養(yǎng)第7天，每皿加人LPS 50ul促進(jìn)DC分化成熟。 
       1.3.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞培養(yǎng)第8天，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行F'ITC , PE雙標(biāo)記熒光檢測，每皿細(xì)胞標(biāo)本平均分裝人3個流式管，每個流式管分別加人兩兩配對熒光抗體(抗CD40-F1TC抗體+抗HLA- DR-PE抗體;抗(:D80-FITC抗體十抗CD86-PE抗體; 抗CCR7-FITC抗體十抗CD83-PE抗體)，共6種抗體，每種抗體各5uL，使用Cellquest操作軟件進(jìn)行收取細(xì)胞及相關(guān)數(shù)據(jù)分析。        
       1.3.3酶聯(lián)免疫吸附法(ELASA)檢測采用ELAS;4 測定DC培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-12水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的實驗步驟進(jìn)行操作。 
       1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SI'SS 19. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以見士、表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗， P < 0. 05表明差異有統(tǒng)計一學(xué)意義。 
       2結(jié)果

       2.1人外周血DC的分離培養(yǎng) 體外培養(yǎng)誘導(dǎo)后觀察發(fā)現(xiàn)DC形成細(xì)胞集落，可見數(shù)個DC聚集在一起，呈懸浮狀(圖1)。從單細(xì)胞形態(tài)上也可見到部分細(xì)胞形成的樹突狀突起。 
       2.2 DC各表面分子的表達(dá)率 采用特異性抗體標(biāo)記經(jīng)流式細(xì)胞儀對DC各表而分子的表達(dá)率進(jìn)行了檢測(圖2).統(tǒng)計學(xué)分析結(jié) 果顯示:ESRD組DC表面分子CD40,CD80,CD86, CD83 ,CCR7和HLA-DR的表達(dá)率均顯著低于正常對照組，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0. 05和 P<0. O1)(表1)。 
       2.3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12水平 ESRD組和正常對照組周血DC培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-12的質(zhì)量濃度分別為(72. 07士3. 03)pg/mL和 ( 23. 97士5. 45 ) pg/mL，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0. 01)。 
       3討論
 

       DC是目前已知的體內(nèi)功能強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell, APC)，也是目前的體內(nèi)惟一能激活初始T細(xì)胞的APC，能夠在缺乏其他任何刺激因子的條件下啟動機(jī)體的免疫反應(yīng)[3]。因此，可以說DC是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動者，在激活T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中具有重要作用。同時，成熟的DC能表達(dá)一系列分化抗原，其中與其功能直接有 關(guān)的是CDIa、主要組織相容性復(fù)合體B類分子 ( major histocompatibility complex II, MHC- II)、人類白細(xì)胞抗原DR ( human leukocyte antigen DR, HLA- DR) ,CD80,CD83和CD86等[4]。 
       本研究結(jié)果表明:體外培養(yǎng)的ESRD組外周血中的DC表達(dá)CD83,HLA-DR,CCR7,CD80,CD86等表面分子的百分比顯著低于正常對照組， CD40尤為明顯。值得注意的是，國內(nèi)外的許多同類研究結(jié)果之間存在著較大差異。如韓國的相關(guān)文獻(xiàn)[5]報道， ESRD患者DC表面MHC II ,CD83,CD86,CCR7表達(dá)與正常對照并無差異;但根據(jù)檢測其他因子(如IL-6 等)，其后還是得出接受維持性血液透析治療的 ESRD患者體內(nèi)DC的功能存在異常并可能導(dǎo)致其免疫缺陷的結(jié)論。其中原因可能既與一些客觀因素如人種差異、透析方式不同有關(guān)，也可能與實驗方法的選擇如誘導(dǎo)DC的細(xì)胞因子濃度和培養(yǎng)時間的長短等因素相關(guān)。 
       國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，CD83是DC的成熟標(biāo)志[6,7] HLA-DR的不表達(dá)或低表達(dá)說明DC提呈外源性抗原 能力低下[8];而 CCR7被認(rèn)為是成熟DC ( mature DC , mDC)遷移歸巢，完成抗原遞呈從而激活初始T細(xì)胞的主要受體之一。結(jié)合本次實驗結(jié)果，我們認(rèn)為 ESRD患者的外周血單核細(xì)胞雖然能與正常人一樣在GM-CSF , IL-4和LPS的刺激下分化成DC，但 ESRD患者外周血單核細(xì)胞源性的DC發(fā)育不成熟，其趨化遷移功能以及外源性抗原遞呈能力下降。有學(xué)者[9]認(rèn)為對ESRD患者進(jìn)行血液透析治療的過程會加劇其DC的功能丟失。另外，CD40,CD80和 CD86作為DC表面重要的共刺激分子，其表達(dá)水平的下降可能直接參與了T細(xì)胞的免疫功能缺陷，表現(xiàn)為T細(xì)胞活化不充分，不能表現(xiàn)效應(yīng)功能而呈無能狀態(tài)，終可能誘導(dǎo)機(jī)體特異性的免疫耐受。有文獻(xiàn)[10].報道抑制DC表面cDBo和CD86的表達(dá)，阻斷共刺激通路，可誘導(dǎo)機(jī)體特異性的免疫耐受，這一觀點與本次實驗結(jié)果相吻合。在進(jìn)一步對T細(xì)胞亞群的研究中發(fā)現(xiàn)，DC細(xì)胞表面CD86的表達(dá)傾向于刺激1'細(xì)胞向Th2轉(zhuǎn)化，CD80的表達(dá)傾向于刺激 T細(xì)胞向Thl分化[11，12]，尤其是C D40分子對Thl發(fā)育非常重要。國外研究指出ESRD患者存在Thl/ Th2細(xì)胞失衡，表現(xiàn)Th2優(yōu)勢[13]。本實驗中CD4。分子水平的顯著降低，或許能很好地推理和解釋這一觀點。 
       然而在本實驗中，似乎出現(xiàn)了一項與上述生理變化過程不符的結(jié)果:既然IL-12是活化T細(xì)胞表達(dá)的CD40L直接誘導(dǎo)DC ( CD40)產(chǎn)生的，那為何在 ESRD組患者C D40分子低表達(dá)的情況下反而會出現(xiàn) IL-12水平的明顯升高呢?其中機(jī)制尚不明確，我們認(rèn)為主要是由于以下原因:①ESRD患者的病因各不相同，在我國主要以慢性腎小球腎炎及糖尿病腎病多見，這兩種疾病患者體內(nèi)均存在微炎癥狀態(tài)，本身基礎(chǔ)的炎癥因子水平就較正常人要高;②ESRD患者體內(nèi)異常蓄積了各種尿毒癥性毒素可能導(dǎo)致全身循環(huán)炎性蛋白、致炎癥性細(xì)胞因子的升高[14];③血液透析過程中所使用的透析液、透析器及體外循環(huán)回路材料的生物不相容性可能在與血液接觸時激活補體或單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-12[14] ;④由于IL-12的相對分子質(zhì)量較大，在使用普通低通量透析器進(jìn)行透析治療時，直接濾除清除較少;⑤即便從生理學(xué)角度分析，IL-12水平本身還受體內(nèi)其他調(diào)控因素影響，與外周血單核細(xì)胞來源DC的分泌水平并非呈線性相關(guān)。但以上原因只是作為理論推測，尚有待于實驗證實。 
       因此，在今后進(jìn)一步的研究中，可以對上述因素加以控制比較，同時探討不同透析膜對ESRD患者 DC功能及CD4 T細(xì)胞活化及極化的影響。 ESRD患者的DC在其不同生理階段均存在著功能的缺陷，本研究從Dc的發(fā)育成熟、趨化遷移、抗原遞呈、免疫激活等角度系統(tǒng)闡明了DC在ESRD患者免疫功能下降中所扮演的角色。研究提示，如果能從調(diào)節(jié)及千預(yù)DC的特異性功能人手，則可能有助于改善ESRD患者的免疫功能，降低感染的發(fā)生率，從而提高患者的生存質(zhì)量和社會回歸率，同時也能降低ESRD患者日益增加的醫(yī)療費用和負(fù)擔(dān)。 
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