RHD 1227A等位基因在Rh陰性人群和隨機(jī)人群中的頻率研究

　　作者：吳俊杰,洪小珍　許先國,馬開榮,朱發(fā)明　　作者單位：浙江省血液中心輸血研究所，衛(wèi)生部血液安全研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310006

　　在過去的10多年里，RH血型的分子生物學(xué)研究有了很大的進(jìn)展，對D抗原的免疫原性也有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)[1-3]。因?yàn)镈EL抗原(只有通過吸收釋放才能檢測到的弱表達(dá)D抗原)有可能快速誘發(fā)抗D免疫事件[4-6]，如何通過準(zhǔn)確的基因分型建立一個(gè)真正的RH陰性供者庫(目前的RH陰性血型包括DEL表型)和分子鑒定各種D突變體成為輸血醫(yī)學(xué)的一個(gè)新熱點(diǎn)[1，2]。充分了解RHD等位基因的多態(tài)性和人群中的頻率是RHD基因分型的必要條件[2]。Gassner等[7]和Doescher等[8]研究發(fā)現(xiàn)，RHD等位基因即使在相鄰地區(qū)也可能有很大的差異; Chen等[9]發(fā)現(xiàn)，從弱D表型推算得到的基因人群頻率和隨機(jī)人群調(diào)查得到的基因人群頻率也不盡一致。我們率先用等位基因特異-聚合酶鏈反應(yīng)(allele specific - polymerase chain reaction, AS-PCR)方法調(diào)查DEL表型的主要等位基因RHD 1227A在Rh陰性人群和隨機(jī)人群中的頻率，并對結(jié)果的臨床意義作了討論。
　　材料和方法
　　對象

　　在2003年10月—2004年10月期間在浙江省血液中心獻(xiàn)血的無親緣關(guān)系Rh陰性獻(xiàn)血員143名作為Rh陰性人群，隨機(jī)選取在浙江省居住或者工作的無親緣關(guān)系獻(xiàn)血員489名作為隨機(jī)人群。
　　Rh表型血清學(xué)鑒定

　　RHD表型鑒定采用常規(guī)鹽水平板法，使用加拿大Dominion公司的IgM和IgG混合的抗D試劑(人單克隆IgM抗D,D175-2細(xì)胞株; 人單克隆IgG抗D， D415 1E4細(xì)胞株)。RhC、Rhc、RhE和Rhe鑒定采用鹽水試管法，試劑為Dominion公司的相應(yīng)單克隆抗體。
　　AS-PCR

　　參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。用特異擴(kuò)增RHD 1227A等位基因的引物： RHDEL-s(上游引物): GACCAAGTTTTCTGGAAA(位置對應(yīng)于AJ299028的68-85)、 RHDEL-a(下游引物): CGAGAGAATTTTGAGCAC (位置對應(yīng)于AB035185的849-832)。一對特異擴(kuò)增人生長激素(HGH)基因429 bp的引物作為內(nèi)對照，HGH-s(上游引物)： GCCTTCCCAACCATTCCCTTA; HGH-a(下游引物)： TCACGGATTTCTGTTGTGTTT。反應(yīng)總體積10 μl，含模板DNA 0.2 μl(約含DNA 20-50 ng)，特異性引物終濃度250 nmol/L，內(nèi)對照引物終濃度50 nmol/L，MgCl2 終濃度1.5 mmol/L，dNTP終濃度 200 mmol/L，Taq酶0.2 U(TaKaRa公司產(chǎn)品)。PCR擴(kuò)增條件： 95℃ 預(yù)變性5分鐘，然后94℃ 變性30秒、58℃ 退火30秒和72℃ 延伸50秒，循環(huán)30次，后72℃延伸5分鐘。產(chǎn)物通過2%瓊脂糖電泳，用凝膠成像儀(Syngene公司產(chǎn)品)觀察結(jié)果。
　　RHD基因外顯子9序列分析

　　參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。用RHD基因外顯子9的特異引物， WD9 s(上游引物): GGTCCAGGAATGACAGGGCT (位置：對應(yīng)于AB035196的4682-4701); WD9 a(下游引物)： CGCTGAGGACTGCAGATAGG (位置：對應(yīng)于AB035185的294-275)，擴(kuò)增覆蓋外顯子9及側(cè)翼序列的532 bp片段。PCR產(chǎn)物用Qiagen公司的膠純化回收試劑盒純化，采用BigDye Sequencing kit(ABI公司產(chǎn)品)試劑盒進(jìn)行測序反應(yīng)，用ABI PRISM 377測序儀進(jìn)行PAGE電泳，Sequence Analysis進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　RHD基因缺失檢測
　　根據(jù)Perco等[12]的方法，用特異性引物μ1-s(上游引物)和rnb31(下游引物) PCR檢測Rhesus hybrid box(AJ252313, 4988-7710區(qū)域)。如果可以擴(kuò)增得到2 778 bp的特異性片段，則表明存在Rhesus hybrid box，有RHD基因的缺失; 反之，則不存在Rhesus hybrid box，沒有RHD基因的缺失。
　　結(jié)果

　　Rh陰性隨機(jī)人群中RHD 1227A的人群頻率
　　對143例Rh陰性人群的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，RHD 1227A陽性的個(gè)體有41例，占Rh陰性人群的28.67%。其中RhCCdee表型8例(19.51%)，RhCcdee表型32例(78.05%)，RhCcdEe表型1例(2.44%)(附表)。在RhCCdEe、Rhccdee、RhccdEe和RhCcdEE表型的Rh陰性隨機(jī)人群中未檢測到RHD 1227A等位基因。采用Perco等的Rhesus hybrid box檢測方法[12]，RHD 1227A陽性的41例Rh陰性人群中有35例可以擴(kuò)增得到2 778 bp的特異性片段，表明存在Rhesus hybrid box，有RHD基因的缺失;有6例不能擴(kuò)增到2 778 bp的片段，表明不存在RHD基因的缺失，RHD 外顯子9序列分析結(jié)果表明，6例都為RHD 1227A等位基因的純合子，即在我們檢測的Rh陰性隨機(jī)人群中，RHD 1227A等位基因的拷貝數(shù)為47，基因頻率為16.43%。Table . Frequency of RHD 1227A allele among random Rh negative popoulation(略)

　　隨機(jī)人群中RHD 1227A的人群頻率
　　在489例隨機(jī)人群中，檢測到7例RHD 1227A陽性個(gè)體，占隨機(jī)人群的1.43%。血清學(xué)檢測表明，這7例個(gè)體都是Rh陽性。外顯子9的序列分析表明，這7例個(gè)體在1227位都是G和A的雜合子(附圖)。用Perco等的方法[12]，該7例RHD 1227A陽性個(gè)體均未擴(kuò)增到2 778 bp的片段，結(jié)果也表明不存在RHD基因的缺失。因此，在我們檢測的489例隨機(jī)人群中RHD 1227A等位基因的拷貝數(shù)為7，基因頻率為0.72%。
　　討論

　　和歐洲不同，亞洲Rh陰性人群有很高比例的DEL表型。在Gassner等[7]和Wagner等[13]的研究中，發(fā)現(xiàn) DEL個(gè)體由RHD 885T(M295I)、RHD 1227A(K409K)、RHD IVS5-38del4、RHD 1252T(Tins)1253A (X418L)和RHDIVS3+1A等位基因引起。在亞洲人群中， DEL表型主要是外顯子9缺失和RHD 1227A[14-19]2種。我們前期的研究結(jié)果表明，浙江漢族DEL表型是由RHD 1227A等位基因引起[10]，并根據(jù)RHD 1227A等位基因的序列設(shè)計(jì)了DEL表型的AS-PCR基因分型方法[11]。采用該AS-PCR方法，我們在143例Rh陰性人群中檢測到41例(28.67%)攜帶RHD 1227A，其中RHCCdee占19.51%，RHCcdee占78.05%， Rh-CcdEe占2.44%。這些結(jié)果和Chen等[14]和Shao等[17]的研究結(jié)果基本一致。在489例隨機(jī)人群中我們發(fā)現(xiàn)7例RHD 1227A陽性個(gè)體。序列分析發(fā)現(xiàn)，這些先證者在RHD基因的1227位都是G和A的雜合子;血清學(xué)檢測表明，是Rh陽性血型。Rhesus hybrid box檢測表明，這7例個(gè)體都不存在RHD基因的缺失。結(jié)合Rhesus hybrid box檢測和RHD基因外顯子9的序列分析結(jié)果推斷的RHD 1227A等位基因的拷貝數(shù)和RHD 1227A等位基因攜帶者在人群中陽性的個(gè)體比例，我們推算出RHD 1227A等位基因在Rh陰性人群和隨機(jī)人群中的基因頻率分別為16.43%和0.72%，和Shao等[14]、Chen等[17]通過Del表型推算的RHD 1227A等位基因在深圳和臺(tái)灣隨機(jī)人群中的頻率基本一致。 Ishikawa等[20]發(fā)現(xiàn)，日本人群中90%的Rh陰性、C陽性和RHD基因陽性的獻(xiàn)血員攜帶RHD 1227A等位基因，而在歐洲人群中，RHD 1227A的基因頻率只有1/9 091[13]。由上述分析可見，RHD 1227A等位基因主要在亞洲人群中有意義。另外，我們在Rh陽性血型個(gè)體中檢測到RHD 1227A。這一方面表明RHD 1227A表達(dá)的抗原很弱，相對于正常RHD等位基因，DEL抗原不被表現(xiàn);另一方面，RHD 1227A隱性攜帶者的子代表現(xiàn)為DEL 表型的要比正常對照高1倍。如果在隨機(jī)人群中開展RhD血型的基因分型，RHD 1227A等位基因的檢測必須和RHD 1227G(正常RHD對照)相結(jié)合，即當(dāng)RHD 1227A陽性、RHD 1227G陰性時(shí)，有比較大的可能是DEL，而當(dāng)RHD 1227A和RHD 1227G都為陽性時(shí)很可能是RHD 1227A的隱性攜帶者、正常D表型?；蚍中头椒ň唧w實(shí)施時(shí)還需考慮其它不表達(dá)等位基因的突變位點(diǎn)的檢測。