聲敏劑血卟啉對COC1/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響及機(jī)制探討

　作者：周曉莉,唐良萏,王燕,彭麗欽　　作者單位：1.樂山市婦幼保健院婦科,四川樂山 614000;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附一院婦科,重慶 400016

　　【摘要】 目的 探討聲敏劑血卟啉對COC1/DDP細(xì)胞順鉑敏感性的影響及其機(jī)制。方法 將人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株COC1/DDP分為A、B、C、D 4組(分別為對照組、單純順鉑組、血卟啉+超聲組、順鉑+血卟啉+超聲組),觀察各組處理后癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞克隆形成情況,聯(lián)合用藥效果及bcl2和bax表達(dá)的變化。結(jié)果 D組COC1/DDP細(xì)胞增殖抑制明顯,細(xì)胞凋亡率升高,均與其他組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),bcl2蛋白陽性表達(dá)率在C、D組顯著降低(P<0.05),A、B組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。bax蛋白陽性表達(dá)率在各組表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 聲動力療法聯(lián)合順鉑能有效地增強(qiáng)對耐藥卵巢癌細(xì)胞的殺傷能力,減少癌細(xì)胞的生成。

　　【關(guān)鍵詞】 卵巢癌; 聲動力療法; 血卟啉; 順鉑

　　A Discussion on Effect and Mechanism of Haematoporphyrin to Chemotherapy Sensitivity of Cisplatin on COC1/DDP

　　ZHOU Xiaoli1,TANG Liangdan2,WANG Yan1,PENG Liqin1

　　(1.Department of Gynecology,Maternal and Child Health Hospital of Leshan City,Sichuan Leshan 614000,China;2.The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

　　【Abstract】 ob[x]jective To determine whether sonodynamic treatment (SDT) can enhance chemotherapy effect of cisplatin on ovarian cancer cells. Methods Drug resistance ovarian cancer cells COC1/DDP were divided into 4 groups randomly:cisplatin (DDP)group,haematoporphyrin(Hp)+ Ultrasound group,cisplatin(DDP)+ haematoporphyrin(Hp)+Ultrasound group and control group.Cell proliferation,apoptosis,protein bcl2 and bax ex[x]pression were observed.Results In DDP+ Hp+Ultrasound group,cell proliferation was greatly inhibited,COC1/DDP cell clone efficiency was the lowest(P<0.05).Bcl2 ex[x]pression in Hp+ Ultrasound group and DDP+Hp+ Ultrasound group deceased significantly (P<0.05),while there were no obvious difference in control goup and cisplatin group.We did not observe great difference in protein bax ex[x]pression in any group (P>0.05). Conlusion SDT could effectively enhance cell killing ability of cisplatin on drug resistance ovarian cancaer cells.

　　【Key words】 ovarian caner; sonodynamic treatment; haematoporphyrin; cisplatin

　　卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,也是婦科腫瘤中預(yù)后差的癌癥,除了難以早期發(fā)現(xiàn)外,化療耐藥是卵巢癌治療失敗的主要原因之一。鉑類藥物為主的聯(lián)合化療是目前卵巢癌的一線化療方案,患者5年生存率一直徘徊在30 %左右?；熌退幍漠a(chǎn)生被認(rèn)為是引起生存率降低的主要原因之一,嚴(yán)重影響了卵巢癌患者的化療療效和生存質(zhì)量?；熌退幨嵌嘁蛩?、多途徑共同作用的結(jié)果,抗癌藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡受阻是其重要機(jī)制之一。因此,尋找一種新興治療理念逆轉(zhuǎn)耐藥或者直接滅活耐藥卵巢癌細(xì)胞是醫(yī)學(xué)工作者亟待解決的關(guān)鍵問題,更是腫瘤康復(fù)中提高女性生產(chǎn)率和改善女性生活質(zhì)量的迫切需要。聲動力療法(SDT)是一種很有應(yīng)用前景的治療腫瘤的方法。大量研究表明,超聲加血卟啉(hematoporphyrin,Hp)比單獨超聲對腫瘤細(xì)胞更具有殺傷效果,血卟啉則無抗腫瘤效應(yīng)[1,2]。有報道說這種殺傷作用機(jī)制是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。在本實驗中,作者把超聲激活的血卟啉聯(lián)合順鉑作用于人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞,觀察其殺傷的作用,以期降低卵巢癌對順鉑化療的耐藥。

　　1 材料、儀器與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 試劑和儀器 超聲增敏劑血卟啉購自Sigma公司,注射用順鉑購自齊魯制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字H37021358),四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、姆薩色素為Sigma公司。血卟啉和MTT均以生理鹽水配成5 mg/ml的溶液,過濾除菌后4 ℃避光保存。超聲裝置為陜西師范大學(xué)聲學(xué)研究所研制,探頭面積為4.7 cm2.

　　1.1.2 細(xì)胞系及培養(yǎng) 腫瘤細(xì)胞株為人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株COC1/DDP(購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)。COC1/DDP在含有0.5 μg/ml順鉑的完全培養(yǎng)基(50 μg/ml青霉素,50 μg/ml鏈霉素和10 %胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基)37 ℃,5 % CO2常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、傳代。實驗前1周換用不含順鉑的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 MTT法檢測各實驗組對COC1/DDP細(xì)胞增殖的影響 把細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,以每孔0.2×104個接種于96孔板中,每孔200 μl完全培養(yǎng)基。12 h后進(jìn)行實驗干預(yù),按以下分組進(jìn)行實驗干預(yù),A組(對照組):單純培養(yǎng)COC1/DDP細(xì)胞;B組(單純順鉑組):在細(xì)胞中加入順鉑,順鉑選0.625、1.25、2.5、5 μg/ml 4個濃度;C組(血卟啉+超聲組):血卟啉選0.012 5、0.025、0.05、0.1 mg/ml 4個濃度,同時進(jìn)行超聲照射60 s;D組(順鉑+血卟啉+超聲組):細(xì)胞液中加入順鉑和血卟啉,使其終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5 μg/ml和0.012 5、0.025、0.05、0.1 mg/ml,同時進(jìn)行超聲照射60 s.每組設(shè)5個復(fù)孔,此時記為0 d;于37℃、5 % CO2的飽和濕度箱中繼續(xù)培養(yǎng)和觀察,于3 d后取出 96孔板,1 200 r/min離心10 min.去上清,加入180 μl完全培養(yǎng)基和20 μl MTT,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h,離心后小心吸棄上清。再加入150 μl DMSO,振蕩10 min,充分溶解。選擇490 nm,在酶標(biāo)儀測定各孔吸光率。實驗重復(fù)3次。按下列公式求出增殖抑制率:腫瘤細(xì)胞增殖抑制率=[1(藥物處理組OD值空白對照組OD值)/(細(xì)胞對照組OD值空白對照組OD值)]×100 %.

　　1.2.2 PI/Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡情況 細(xì)胞生長達(dá)80 %融合時消化傳代,以每孔0.3×104個接種于96孔板中,每孔200 μl完全培養(yǎng)基。12 h后進(jìn)行實驗干預(yù),分組同前,72 h后,每孔依次加入細(xì)胞染色緩沖液100 μl、Hoechst染色液0.5 μl、PI染色液0.5 μl冰浴30 min,PBS洗滌1次,再在熒光顯微鏡下觀察。計數(shù)凋亡細(xì)胞比例。

　　1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測實驗干預(yù)后COC1/DDP細(xì)胞內(nèi)bcl2和bax表達(dá)的變化 選取對數(shù)生長期的COC1/DDP細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,按2×104/ml接種于24孔培養(yǎng)板,繼續(xù)培養(yǎng)12 h后按前述方法進(jìn)行分組處理。各組細(xì)胞經(jīng)實驗處理后置于37 ℃,5 % CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)8 h,收集細(xì)胞,涂布細(xì)胞于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上,室溫風(fēng)干,純丙酮室溫固定30 min.按免疫組化試劑盒使用說明書分別進(jìn)行:純甲醇加過氧化氫至0.5 %,室溫30 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶,蒸餾水洗滌后，滴加免抗bcl2(或bax)基因抗原的抗體,置濕盒中37℃,20 min,0.01 N PBS洗2 min×3次后，滴加生物素化羊抗兔IgG,置濕盒中37℃,20 min.0.01 N PBS洗2 min×3次后滴加SABC 37 ℃,20 min,0.01 N PBS洗5 min×4次后，DAB顯色10 min,蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞漿著色呈棕黃色的為陽性細(xì)胞,每張片隨機(jī)計數(shù)3個視野,每樣品取5張片的平均值為陽性表達(dá)率。

　　1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

　　所獲實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析,進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗。預(yù)先用Homogeneity of Variances進(jìn)行方差齊性檢驗,如方差齊采用LSD檢驗,如方差不齊采用TamhaaeT2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 MTT法檢測各實驗組對COC1/DDP細(xì)胞增殖的影響

　　順鉑、血卟啉、順鉑和血卟啉聯(lián)用對COC1/DDP細(xì)胞增殖的影響兩種方法聯(lián)用的增殖抑制率隨著各自濃度的增加而增加,各組與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。順鉑和血卟啉聯(lián)合作用下COC1/DDP細(xì)胞的細(xì)胞增殖MTT實驗OD值表2 順鉑和血卟啉聯(lián)合作用下COC1/DDP細(xì)胞的增殖抑制率

　　2.2 順鉑和血卟啉聯(lián)合應(yīng)用對COC1/DDP細(xì)胞凋亡的影響

　　順鉑組和血卟啉組的凋亡率高于空白對照組,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);血卟啉+順鉑組與血卟啉組和順鉑組相比,其凋亡率高于血卟啉組和順鉑組,其差異均有顯著性(P<0.05)。提示血卟啉和順鉑都對COC1/DDP細(xì)胞有促進(jìn)凋亡的作用,而且血卟啉和順鉑聯(lián)用能夠加強(qiáng)這種促進(jìn)作用。順鉑和血卟啉聯(lián)合作用下COC1/DDP細(xì)胞的凋亡率

　　2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測實驗干預(yù)后COC1/DDP細(xì)胞內(nèi)bcl2和bax表達(dá)的變化

　　bcl2免疫組化染色光學(xué)顯微鏡下觀察到空白對照組和順鉑組中可見許多細(xì)胞內(nèi)胞漿呈棕黃色,高倍鏡下可見胞漿內(nèi)有大量棕黃色顆粒,而血卟啉+超聲組和順鉑+血卟啉+超聲組此種細(xì)胞明顯減少。Bax蛋白的免疫組化染色可見在血卟啉+超聲組和順鉑+血卟啉+超聲組中有較多的胞漿呈棕黃色顆粒的細(xì)胞,而對照組和順鉑中的此種細(xì)胞較少,bcl2蛋白及bax表達(dá)陽性率。統(tǒng)計分析結(jié)果表明:血卟啉+超聲組和順鉑+血卟啉+超聲組的bcl2蛋白陽性表達(dá)率顯著降低(P<0.05),而空白對照組和順鉑組的細(xì)胞內(nèi)bcl2蛋白陽性表達(dá)率差異無顯著性(P>0.05)。bax蛋白陽性表達(dá)率在各組表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。順鉑和血卟啉聯(lián)合作用下COC1/DDP細(xì)胞的bcl2蛋白及bax表達(dá)陽性率

　　3 討論

　　聲動力療法(SDT)是指對腫瘤患者靜脈注射聲敏劑,而后用一定頻率和強(qiáng)度超聲輻射腫瘤部位,使聚集在腫瘤部位聲敏劑產(chǎn)生抗腫瘤因子而殺傷腫瘤細(xì)胞,抑制腫瘤的生長。有學(xué)者認(rèn)為由于超聲發(fā)生空化作用,其結(jié)果是來源于聲敏劑的自由基,再與氧分子反應(yīng)生成過氧基和烷氧基,過氧基和烷氧基與溶液中的有機(jī)分子反應(yīng)活性低,更易于到達(dá)靶細(xì)胞的表面,破壞癌細(xì)胞的脂質(zhì)和細(xì)胞膜,導(dǎo)致膜通透性增強(qiáng)而損傷細(xì)胞,此外,過氧基和烷氧基還可以導(dǎo)致癌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性,染色體變異等破壞細(xì)胞。目前認(rèn)為較好的聲敏劑仍是卟啉類為主[4],因此本實驗選擇血卟啉做聲敏劑能對超聲有良好的敏感性,產(chǎn)生大量活性氧對細(xì)胞進(jìn)行殺傷作用。

　　本實驗發(fā)現(xiàn),COC1/DDP細(xì)胞對順鉑明顯耐藥,血清峰值濃度(2.5 g/ml)以下的順鉑對COC1/DDP細(xì)胞增殖未見明顯影響,這與文獻(xiàn)報道基本一致[5]。但與血卟啉合用時,血清峰值濃度以下的順鉑明顯抑制了COC1/DDP細(xì)胞增殖。提示超聲激活的血卟啉能夠提高耐藥的卵巢癌細(xì)胞COC1/DDP對順鉑的敏感性,從而增加順鉑對該細(xì)胞的殺傷作用。干擾細(xì)胞周期并誘導(dǎo)凋亡是順鉑治療腫瘤的重要途徑,而血清峰值濃度的順鉑對COC1/DDP的凋亡率幾乎無影響,但與血卟啉合用時,可致細(xì)胞凋亡率明顯升高，這提示超聲激活的血卟啉提高耐藥細(xì)胞株COC1/DDP對順鉑敏感性的機(jī)制可能是恢復(fù)了耐藥細(xì)胞株的凋亡途徑,從而恢復(fù)了順鉑治療腫瘤的作用。

　　細(xì)胞凋亡是在基因控制下的細(xì)胞自身消亡過程,涉及一系列的基因表達(dá)的級聯(lián)反應(yīng),受凋亡抑制基因(bc12/bax)和凋亡促進(jìn)基因的調(diào)控。順鉑可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但耐藥卵巢癌細(xì)胞中bc12/bax明顯增高,這是導(dǎo)致細(xì)胞耐藥的重要原因之一。因此,抗腫瘤治療中,有效地降低bc12/bax含量是取得療效的關(guān)鍵之一。

　　已有研究發(fā)現(xiàn),提高細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平,細(xì)胞凋亡的發(fā)生率明顯增加,認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)的ROS作為一種信使分子在調(diào)控細(xì)胞生存及凋亡過程中起關(guān)鍵作用[6,7]。1988年,Vaux等[8] 首先證實bcl2基因高表達(dá)可明顯延長細(xì)胞的生存周期。體外研究亦表明bcl2可阻止許多刺激物誘發(fā)的細(xì)胞凋亡,且bcl2的抑制可能是細(xì)胞凋亡的共同通道[9]。 bax是bcl2家族的另一成員,與bcI2形成異二聚體,也對細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控[10]。在體內(nèi),bcl2與bax相互影響,相互拮抗,其作用并不直接表現(xiàn)為單獨的bcl2和bax對凋亡的影響,而是由bcl2/bax來決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。研究顯示，bc12/bax比值降低,可使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,作為細(xì)胞調(diào)亡調(diào)控的主要因子bcl2蛋白家族,尤其是bcl2和bax的相互作用在調(diào)亡的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。本實驗的 bcl2蛋白及bax蛋白免疫細(xì)化染色結(jié)果顯示，超聲激活的血卟啉聯(lián)合順鉑作用人卵巢癌細(xì)胞株COC1/DDP，bcl2蛋白水平顯著低于對照組(P<0.05);而順鉑組和對照組比較,bcl2蛋白陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明超聲激活的血卟啉聯(lián)合順鉑作用可以降低人卵巢癌細(xì)胞株COC1/DDP的bcl2蛋白的表達(dá)水平,bax蛋白表達(dá)水平在實驗組及對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,提示聲動力作用是通過下凋bcl2蛋白的水平,使bcl2/bax的比值下降來促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞株COC1/DDP發(fā)生凋亡。

　　聲動力療法(SDT)是繼手術(shù)、放療、化療后新興的一種腫瘤治療手段,具有無創(chuàng)、細(xì)胞毒性低、選擇性殺傷等優(yōu)點。本實驗僅初步研究了超聲激活的血卟啉聯(lián)合順鉑對耐藥的卵巢癌細(xì)胞的作用,還需要進(jìn)一步增加超聲的劑量,將血卟啉的濃度范圍擴(kuò)大,找出三者協(xié)同作用的佳比例,為以后應(yīng)用于臨床提供理論基礎(chǔ)。

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