HCMV pp65 DNA疫苗的純化與檢定

王興滿,湯仁樹(shù),趙俊,陳敬賢,王明麗　　作者單位：合肥 安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室;教育部“重要遺傳疾病基因資源利用”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(省部共建)
　　【摘要】目的：研究HCMV pp65 DNA 疫苗(pcDNA3.1-pp65)的純化工藝，并建立質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。方法：對(duì)工程菌(DH5α/ pcDNA3.1-pp65)的高效發(fā)酵菌體采用堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒初提;三步柱層析(依次為分子篩層析、親和層析、陰離子層析)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行純化，檢測(cè)質(zhì)粒含量、超螺旋比例、內(nèi)毒素等，后對(duì)終產(chǎn)品質(zhì)粒溶液進(jìn)行全面質(zhì)量檢定。結(jié)果 質(zhì)粒初提液通過(guò)分子篩層析后，去除了大量RNA、宿主DNA、內(nèi)毒素等，再經(jīng)親和柱純化后獲得了高比例的超螺旋質(zhì)粒DNA，達(dá)95%，經(jīng)陰離子柱層析有效去除內(nèi)毒素，質(zhì)粒得率為0.8～0.95 mg/ g菌，質(zhì)?？偦厥章蔬_(dá)72.7 %。三批終產(chǎn)品全面質(zhì)量檢定均符合規(guī)定。結(jié)論：建立了穩(wěn)定的HCMV pp65 DNA疫苗(pcDNA3.1-pp65)純化工藝及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為進(jìn)一步研究奠定了重要基礎(chǔ)。
　　【關(guān)鍵詞】 HCMV pp65 DNA疫苗;質(zhì)粒;純化
　　[Abstract]ob[x]jective To develop a procedure of purification and a standard for quality control of HCMV pp65 DNA vaccine.Methods To extract plasmids from recombinant E. coli DH5 α/ pcDNA3.1-pp65 by alkaline Lysis respectively and purify by three steps of chromatography ，i . e. molecular sieve ，affinity and anion exchange chromatography. Control tests were performed on the purified plasmids.Results Most of foreign matters such as RNA ，host DNA and endotoxin were removed from the crude extract of plasmids by molecular sieve chromatography. After affinity chromatography ，the proportion of supercoiled plasmid DNA reached 95 %. After anion exchange chromatography ，endotoxin was removed effectively ，and the plasmids were concentrated. The yield and total recovery rate of plasmids reached 0. 8～0.951 mg/ g bacteria and 72.7 % respectively. All the quality control indexes of three batches of final products of plasmids met the relevant requirements.Conclusion A stable procedure of purification as well as a standard for quality control of HCMV pp65 DNA vaccine were developed ，which laid a foundation for further study.
　　[Key words]HCMV pp65 DNA vaccine;Plasmid;Purification
　　人巨細(xì)胞病毒(HCMV)是皰疹病毒的β亞科中基因組大的DNA病毒，在發(fā)達(dá)國(guó)家中人群感染率為40%～60%，而在發(fā)展中國(guó)家?guī)缀踹_(dá)到。感染后，不能被機(jī)體清除，而是在機(jī)體免疫系統(tǒng)控制下處于潛伏感染狀態(tài)。但是，在免疫功能狀態(tài)低下(如孕期、艾滋病、放射損傷、器官移植等)時(shí)，潛伏的病毒易被激活，出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，往往是致死性的[1，2]。近期研究發(fā)現(xiàn)，HCMV血清抗體陽(yáng)性的正常人群外周血中存在高比例的HCMV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞前體(CTLp);同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在免疫狀態(tài)低下者及鼠動(dòng)物模型中，HCMV特異性CTL數(shù)量及功能的恢復(fù)同疾病的預(yù)后呈明顯正相關(guān)。因此，特異性細(xì)胞免疫對(duì)HCMV持續(xù)性感染的控制和急性疾病的恢復(fù)起主導(dǎo)作用，尤其是CD8+CTL對(duì)控制HCMV感染是必須的[3，4]。 由于該病毒結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，所編碼的蛋白質(zhì)超過(guò)227種，但是能夠誘導(dǎo)特異性CTL的為數(shù)不多，而HCMV主要被膜磷蛋白pp65是HCMV特異性CTL的主要的靶分子[3，4]。HCMV pp65作為CTL細(xì)胞的主要識(shí)別位點(diǎn)，能廣泛誘導(dǎo)機(jī)體特異的細(xì)胞免疫反應(yīng)，對(duì)其進(jìn)行T細(xì)胞表位的研究有助于研究HCMV細(xì)胞免疫的機(jī)制、并為基于表位基礎(chǔ)上的疫苗研制及免疫干預(yù)治療等奠定基礎(chǔ)。本研究以HCMV AD169株中擴(kuò)增出pp65全長(zhǎng)基因，克隆至真核表達(dá)載體，制備了pcDNA3.1-pp65 DNA疫苗的基礎(chǔ)上[5]，主要對(duì)HCMV pp65 DNA 疫苗(pcDNA3.1-pp65)的純化工藝和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立進(jìn)行初步的研究。這將為預(yù)防母體原發(fā)性感染，阻止先天性HCMV感染尋找新的有效途徑。
　　1 材料與方法
　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料
　　重組DNA質(zhì)粒pcDNA3.1-pp65由本室構(gòu)建，大腸桿菌 DH5α由本室保存，質(zhì)粒pcDNA3.1-pp65轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)篩選獲得高拷貝工程菌菌株DH5α/ pcDNA3.1-pp65;DU640核酸蛋白檢測(cè)儀為BECKMAN公司產(chǎn)品;填料 Sepharose 4 FF、 Plasmid Select 和SOURCE 30Q均為GE Healthcare公司產(chǎn)品;層析柱5×100 cm、3.5×50 cm和5×30 cm均購(gòu)自上海通用生物技術(shù)公司;Tris堿和EDTA為Roche 進(jìn)口分裝;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
　　1.2 質(zhì)粒初提
　　按常規(guī)堿裂解法進(jìn)行。稱取適量菌體，依次加入 P1:50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/ L EDTA，pH8.0(無(wú)RNase)，冰浴10 min;P2:200 mmol/ L NaOH，1 %SDS，冰浴4 min;P3：3.0 mol/ L KAC，pH 5.5，冰浴10 min，高速離心，棄沉淀，上清加入0.7倍的異丙醇，以12 000 r/ min，離心20 min。同時(shí)取適量上清，按QIAGEN 試劑盒抽提質(zhì)粒，計(jì)算單位菌量的質(zhì)粒含量，并電泳檢測(cè)超螺旋質(zhì)粒 DNA 比例。用適量BufferⅠ(10 mmol/ L EDTA， 100 mmol/ L Tris-HCl，pH 7.0)溶解沉淀，4℃ 保存?zhèn)溆谩?br /> 　　1.3 質(zhì)粒純化
　　采用AKTA explore 100 (Amershamica 公司)純化系統(tǒng)對(duì)裂解初提液進(jìn)行三步純化。
　　1.3.1 Sepharose 4 FF分子篩層析(5×100 cm)
　　上樣裂解后的質(zhì)粒初提液，流速6 ml/ min，Buffer Ⅰ洗脫，收集洗脫峰1、2，留樣檢測(cè)含量和超螺旋質(zhì)粒比例。
　　1.3.2 Plasmid Select 親和層析(3. 5×50 cm)
　　上樣分子篩峰1，并用Buffer Ⅱ[含3 mol/ L (NH4)2SO4的BufferⅠ]進(jìn)行稀釋，再以 Buffer Ⅲ[含 2 mol/ L((NH4)2SO4的BufferⅠ]平衡及洗柱，流速15 ml/ min，用Buffer Ⅳ[含 2 mol/ L (NH4)2SO4，1.4 mol/ L NaCl 的Buffer Ⅰ]進(jìn)行質(zhì)粒洗脫，留樣檢測(cè)含量和超螺旋質(zhì)粒比例。
　　1.3.3 SOURCE 30Q陰離子柱層析(5×30cm)
　　用Buffer Ⅴ(含 0.4 mol/ L NaCl 的BufferⅠ)平衡柱，流速20 ml/ min，上樣經(jīng)適量無(wú)熱原水稀釋的親和柱Buffer Ⅳ(含 1.0 mol/ L NaCl 的BufferⅠ)洗脫峰，以Buffer Ⅵ 梯度洗脫質(zhì)粒峰，留樣檢測(cè)含量、超螺旋質(zhì)粒比例和內(nèi)毒素。
　　1.4 質(zhì)粒的質(zhì)量檢測(cè)
　　1.4.1 含量和A260/ A280的測(cè)定
　　用DU640核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定。
　　1.4.2 瓊脂糖電泳和凝膠成像分析
　　采用1.0%膠，常規(guī)進(jìn)行瓊脂糖電泳，采用 BIO-PROFIL Image Analysis Software 分析RNA含量和質(zhì)粒超螺旋比例。
　　1.4.3 鑒別試驗(yàn)
　　按規(guī)定進(jìn)行限制性酶譜分析。
　　1.4.4 宿主DNA殘留檢測(cè)
　　采用DIGDNA Labeling and Detection Kit (Roche 公司)，按 《中國(guó)藥典》三部(2005版)進(jìn)行。
　　1.4.5 宿主蛋白殘留檢測(cè)
　　按《中國(guó)藥典》三部(2005版)進(jìn)行。
　　1.4.6 內(nèi)毒素含量檢測(cè)
　　按《中國(guó)藥典》三部(2005版)進(jìn)行。
　　上述各項(xiàng)檢測(cè)的質(zhì)量控制限度參考美國(guó) FDA標(biāo)準(zhǔn)[6]以及我國(guó)人基因治療用產(chǎn)品的技術(shù)指導(dǎo)原則。
　　2 結(jié)果
　　2.1 質(zhì)粒的初提
　　每次取菌量約30 g裂解，并加入大量的緩沖液使其充分裂解，取含質(zhì)粒的上清液30～50 ml，按QIAGEN試劑盒說(shuō)明提取質(zhì)粒，后計(jì)算單位菌量的相應(yīng)質(zhì)粒含量為1.1～1.4 mg/ g菌，電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA超螺旋比例為88%～91%，說(shuō)明質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)因裂解過(guò)程產(chǎn)生的剪切力作用而受到一定程度的破壞。
　　2.2 三步柱層析純化
　　2.2.1 分子篩層析
　　裂解后的質(zhì)粒初提液經(jīng)分子篩純化后，層析圖譜上有2個(gè)明顯的吸收峰，見(jiàn)圖1A。其電泳圖譜表明質(zhì)粒DNA與大量RNA、宿主DNA、內(nèi)毒素等雜質(zhì)得到有效分離，見(jiàn)圖1B，其中2泳道可見(jiàn)有3條帶，從上至下分別為質(zhì)粒的開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)(open cycle)、 線性結(jié)構(gòu)(liner DNA)和超螺旋結(jié)構(gòu)(Supercoiled DNA)，進(jìn)一步表明在裂解過(guò)程中質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)對(duì)剪切力較為敏感。經(jīng)電泳掃描，質(zhì)粒超螺旋比例約為90%。
　　2.2.2 Plasmid Select親和層析
　　將收集的分子篩峰1稀釋后上樣于 Plasmid Select 柱，此柱可選擇性吸附超螺旋質(zhì)粒DNA ，而開(kāi)環(huán)和線性質(zhì)粒被穿流出來(lái)。上樣時(shí)可見(jiàn)有一緩緩的流穿峰，用Buffer IV洗脫有一高吸收峰，見(jiàn)圖2A。從電泳圖譜可見(jiàn)，在層析過(guò)程中，上樣的緩緩流穿峰為受損的超螺旋質(zhì)粒即開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)質(zhì)粒(oc)，而吸附于柱上被洗脫下來(lái)的則為超螺旋質(zhì)粒DNA(sc)，見(jiàn)圖2B，經(jīng)掃描分析，質(zhì)粒超螺旋比例為95%。
　　2.2.3 SOURCE 30Q柱層析
　　PS親和柱的質(zhì)粒洗脫峰經(jīng)無(wú)熱原水稀釋后，上樣于30Q陰離子柱，層析圖譜見(jiàn)圖3A，將收集的質(zhì)粒洗脫峰經(jīng)鱟試劑法檢測(cè)，內(nèi)毒素含量小于10 EU/mg質(zhì)粒，電泳圖譜見(jiàn)圖3B，超螺旋質(zhì)粒DNA比例為95%，質(zhì)粒線性片段大小為1 686 bp，圖譜中只有質(zhì)粒DNA含量較少的oc結(jié)構(gòu)和占95%的sc結(jié)構(gòu)，位置完全正確。質(zhì)粒得率為 0.8～0.95 mg/g菌，質(zhì)粒的總回收率可達(dá)72.7%。
　　2.3 終產(chǎn)品的質(zhì)量檢測(cè)
　　純化的3批以超螺旋質(zhì)粒DNA為終產(chǎn)品的溶液制劑經(jīng)檢定，各項(xiàng)指標(biāo)均符合規(guī)定，質(zhì)粒具有均一性，超螺旋比例達(dá)90%以上，片段大小及酶譜正確，見(jiàn)圖4。宿主DNA及蛋白質(zhì)殘留量極低，詳見(jiàn)表1。表1 3批質(zhì)粒的質(zhì)量檢定結(jié)果(略)
　　3 討論
　　目前仍未獲得一種安全而有效的HCMV疫苗，機(jī)體的自然免疫反應(yīng)不能消滅HCMV。HCMV的DNA疫苗研究如同HBV、HEV等同樣需要面對(duì)病毒高度變異導(dǎo)致的免疫逃逸問(wèn)題。目前多采用病毒結(jié)構(gòu)中保守性較高的序列。再者CTL抗原結(jié)合表位的多樣性，也可導(dǎo)致HCMV的免疫逃逸，如果抗原結(jié)合表位的結(jié)構(gòu)包含有自身抗原成分，所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)就會(huì)與正常組織有交叉反應(yīng)，使疫苗特異性降低或完全喪失。所以，選用HCMV結(jié)構(gòu)保守性且為病毒存活或致病所必要，并與人體組織抗原成分無(wú)相似性的病毒DNA用作DNA免疫是必需的。
　　pp65為HCMV主要被膜磷蛋白，在HCMV AD169株的標(biāo)準(zhǔn)序列中，其編碼基因UL83位于119352～121037(互補(bǔ)鏈)，全長(zhǎng)1686bp，編碼561氨基酸，在不同的HCMV病毒株中，pp65具有高度的保守性，抗原決定簇變異較少[7]，而且，HCMV 特異性CTL識(shí)別的主要靶分子為pp65，并且表明沒(méi)有任何新的蛋白合成時(shí)，pp65就可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性CTL。因此，pp65 CTL細(xì)胞反應(yīng)在HCMV防治研究中有著巨大潛力[3，4，8，9]。
　　美國(guó) FDA和我國(guó) SFDA均明確規(guī)定人基因治療用質(zhì)粒中超螺旋質(zhì)粒 DNA 比例應(yīng)在 90 %以上。由于質(zhì)粒DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)在體內(nèi)可以更有效地表達(dá)，而破損的或開(kāi)環(huán)的以及線性質(zhì)粒DNA在體內(nèi)表達(dá)率低，且可能存在一定的安全隱患[10]，因此，質(zhì)粒的質(zhì)量在一定程度上就是指其超螺旋結(jié)構(gòu) DNA 的含量。目前，影響質(zhì)粒純化質(zhì)量的因素很多。據(jù)計(jì)算 ，發(fā)酵得到的單位菌量的裂解物中，質(zhì)粒 DNA 僅占1%～3%[11]。如何得到高純度的尤其是超螺旋比例高的質(zhì)粒DNA，大限度地提高質(zhì)粒收率，一直是純化工作的目標(biāo)。
　　質(zhì)粒DNA存在于發(fā)酵菌胞內(nèi)，裂解細(xì)胞是初提質(zhì)粒的關(guān)鍵一步。既要保證質(zhì)粒從細(xì)胞中釋放完全，又要確保其超螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。目前用于細(xì)胞裂解的方法有多種，本研究中仍然采用傳統(tǒng)堿裂解法，已達(dá)到中試規(guī)模。在裂解過(guò)程中沒(méi)有使用動(dòng)物源性RNase，并對(duì)大量的裂解液進(jìn)行了適當(dāng)?shù)某吻搴蜐饪s處理，減輕了后續(xù)色譜工藝的負(fù)荷。通過(guò)多次探索性和重復(fù)性放大試驗(yàn)表明，細(xì)菌裂解是完全的，質(zhì)?；厥章瘦^高，但純度達(dá)不到要求，需要進(jìn)一步純化。質(zhì)粒純化的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法是蔗糖/氯化銫-溴化乙錠密度梯度離心，但該法不僅耗時(shí)、難以放大，且使用了有毒的誘變?cè)噭?，不適合臨床用質(zhì)粒的制備。為了達(dá)到質(zhì)粒的臨床使用標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)粒的純化多采用色譜層析，近年來(lái)已有較多報(bào)道[12，13]。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)多次小規(guī)模實(shí)驗(yàn)積累，成功摸索出三步質(zhì)粒純化法，在整個(gè)試驗(yàn)中，所選用的層析介質(zhì)均是惰性的，所使用的緩沖液組成均為常規(guī)無(wú)毒試劑。在每一步操作中，均及時(shí)通過(guò)電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA的超螺旋比例，以評(píng)價(jià)純化效果。3 種填料的流速較快，樣品在柱中停留的時(shí)間較短，大大縮短了純化時(shí)間，從而提高處理量和純化效率，且填料耐酸堿能力強(qiáng)，可清潔再生，反復(fù)使用。
　　連續(xù)生產(chǎn)3 批質(zhì)粒，并按臨床用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢定，結(jié)果均符合規(guī)定，且3批產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果基本一致。我們所建立的HCMV pp65 DNA疫苗的純化工藝穩(wěn)定、可控，且成本低，為HCMV pp65 DNA疫苗的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　【參考文獻(xiàn)】
　　[1]Hillyer CD, Snydman DR, Berkman EM. The risk of cytomegalovirus infection in solid organ and bone marrow transplant recipients: transfusion of blood products. Transfusion,1990,30(7): 659-666.
　　[2]Vogel JU, Scholz M, Cinatl J Jr. Treatment of cytomegalovirus diseases. Intervirology,1997,40(5):357-367.
　　[3]Schalich J, Vytvytska O, Zauner W, et al. Analysis of the human cytomegalovirus pp65-directed T-cell response in healthy HLA-A2-positive individuals. Biol Chem,2008,389(5)：551-559.
　　[4]Kim EK, Cho HI, Yoon SH, et al. Efficient generation of survivin-specific cytotoxic T lymphocytes from healthy persons in vitro: quantitative and qualitative effects of CD4+ T cells. Vaccine,2008,26(32):3987-3997.
　　[5]李艷秋，余莉，方草暉，等. HCMV pp65 DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38(2)：98-102.
　　[6]US FDA. Guideline1Guidance for human somatic cell therapy and gene therapy1Hum. Gene Ther,1998,9(10):1513-1524.
　　[7]Solache A, Morgan CL, Dodi AI, et al. Identification of three HLA-A*0201-restricted cytotoxic T cell epitopes in the cytomegalovirus protein pp65 that are conserved between eight strains of the virus .J Immunol,1999,163(10):5512-5518.
　　[8]Yang R, Xia T, Xu G, et al. Human cytomegalovirus specific CD8(+) T lymphocytes display interferon-gamma secretion impairment in kidney transplant recipients with pp65 antigenemia. Transplant Proc,2008，40(10):3500-3504.
　　[9]Cantisán S, Torre-Cisneros J, Lara R, et al. Age-dependent association between low frequency of CD27/CD28 ex[x]pression on pp65 CD8+ T cells and cytomegalovirus replication after transplantation. Clin Vaccine Immunol，2009，16(10):1429-1438.
　　[10]Ledwith BJ,Manam S,Troilo PJ,et al. Plasmid DNA vaccines: investigation of integration into host cellular DNA following intramuscular injection in micel. Intervirology,2000,43 (426):258-272.
　　[11]Schleef M,Schmidt T.Animal- free production of ccc-supercoiled plasmids for research and clinical applications. J Gene Med,2004,6 (1):s45-s53.
　　[12]Ferreira GM,Monterio GA,Prazeres DM,et al. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends Biotechnol,2000,18(9):380-388.
　　[13]Diogo MM,Queiroz JA,Prazeres DMF. Studies on the retention of plasmid DNA and E-coli nucleic acids by hydrophobic interaction chromatography. Bioseparation,2001,10 (425):211-220.