膽管癌細胞層黏連素受體過表達上調Fas配體的研究

【摘要】  目的 探討膽管癌細胞層黏連素受體(laminin receptor,LNR)過表達與Fas配體(Fas ligand,FasL)作用的關系。方法 采用脂質體轉染法轉染順義、反義LNR寡核苷酸至膽管癌細胞QBC939中，用RTPCR和細胞免疫組織化學方法檢測兩組細胞FasL及LNR的表達情況。結果 轉染反義組LNR和FasL基因表達均較轉染順義組明顯降低(t=14.136,25.161,P<0.01)。結論 LNR過表達在膽管癌免疫逃逸中的作用可能是通過FasFasL信號通路實現(xiàn)的。

【關鍵詞】  膽管腫瘤； 層黏連素受體； Fas配體

     Overex[x]pression of laminin receptor in upregulating Fas ligand in cells of cholangiocarcinoma  GAO Zhanfeng, LI Tianyu, GAO Yinghong, JIANG Weiwei, WU Hongye, WANG Shuguang. Institute of Hepatobiliary Surgery & Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

    Corresponding author: WANG Shuguang, Email: sgwang90@yahoo.com.cn

    【Abstract】  ob[x]jective  To explore the relationship between overex[x]pression of laminin receptor(LNR) and Fas ligand (FasL) in cells of cholangiocarcinoma. Methods  Sense and antisense oligonucleotides of LNR were transfected into the cholangiocarcinoma cell line QBC939 by the method of liposome transfection. The ex[x]pressions of FasL and LNR were detected by RTPCR and immunohistochemistry. Results  Compared with sense oligonucleotide of LNR, the ex[x]pression of LNR and FasL in antisense oligonucleotide of LNR was significantly downregulated (t=14.136, 25.161, P<0.01).Conclusions  The effect of overex[x]pression of LNR on immune evasion of cholangiocarcinoma is realized via the Fas/FasL pathway.

    【Key words】  Cholangiocarcinoma;  Laminin receptor;  Fas ligand

    層黏連素(laminin，LN)是細胞外基質(extracellular matrix,ECM) 的主要成分。腫瘤細胞膜上含有其配體即層黏連素受體(laminin receptor，LNR)，兩者結合可誘導分泌包括IV型膠原酶在內的蛋白水解酶, 后者有助于腫瘤細胞的侵襲和轉移。我們前期研究發(fā)現(xiàn)LNR過表達與臨床膽管癌惡性表型關系密切［1-4］。本研究將探討LNR在膽管癌免疫逃逸機制中與Fas配體(Fas ligand,FasL)作用的關系。

    1  材料與方法

    1.1  試劑

    RPMI 1640培養(yǎng)液、胰酶和胎牛血清均購自美國Hyclone公司；鼠抗人層黏連蛋白受體單克隆抗FastTM Transfection Reagent轉染試劑盒和SV Total RNA Isolation System試劑盒購自美國Promega公司；逆轉錄試劑盒購自杭州博日科技公司；PCR試劑盒購自日本TOYOBO公司。

    1.2  細胞培養(yǎng)

    人肝外膽管癌細胞株QBC939是一株來源于人肝門部膽管癌的右肝轉移灶，為低分化腺癌，由本研究所王曙光建株保存［5］。在37 ℃，5% CO2條件下，含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 mg/L)的RPMI 1640培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng)和傳代。

    1.3  設計合成LNR順義、反義寡核苷酸

    按反義寡核苷酸的設計要求，針對LNR mRNA序列(Gene Bank：NM 002295)核心區(qū)的AUG上、下游序列，設計18聚同源和互補的寡核苷酸［6］。所設計的序列如下：LNR反義寡核苷酸序列(18mer)：5’GGCTCCGGACATTGTGAA3’；LNR順義寡核苷酸序列(18mer)：5’TTCACAATGTCCGGAGCC3’。LNR順義、反義寡核苷酸(全硫代修飾)+綠色熒光標記由上海生物工程技術服務有限公司合成。

    1.4  順義組、反義組LNR細胞轉染

    取對數(shù)生長期QBC939細胞5×105個/ml，采用脂質體轉染法，具體操作方法同參考文獻［7］。轉染劑量為LNR順義組、反義組寡核苷酸各3 μg，按DNA∶脂質體=1∶2進行轉染。轉染后48 h行細胞免疫組織化學和提取細胞總RNA進行RTPCR，檢測LNR和FasL蛋白的mRNA表達。

    1.5  圖像處理和統(tǒng)計學分析

    采用Quantity one凝膠定量分析軟件對RTPCR凝膠條帶進行分析，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

    2  結果

    2.1  順義組、反義組LNR細胞轉染

    順義組和反義組細胞轉染效率均達到95%以上(圖1，2)。

    2.2  順義組、反義組LNR細胞免疫組織化學

    LNR和FasL陽性反應物成棕黃色顆粒，主要位于細胞膜和胞質內。轉染反義組LNR陽性表達較轉染順義組明顯降低，說明通過轉染反義的LNR寡核苷酸可以沉默LNR基因表達(圖3，4)。同樣，轉染反義組FasL陽性表達較轉染順義組明顯降低(圖5，6)。

    2.3  順義組、反義組LNR QBC939細胞RTPCR

    LNR和FasL mRNA RTPCR檢測結果見圖7。用Quantity one凝膠定量分析軟件對RTPCR凝膠條帶進行灰度掃描分析(圖8)。轉染反義組LNR和FasL基因表達均較轉染順義組明顯降低(t=14.136,25.161,P<0.01)。

    3  討論

    在大多數(shù)情況下，腫瘤細胞能夠逃避機體的免疫監(jiān)視和攻擊，進而在體內不受限制地生長和發(fā)生遠處轉移。其中，腫瘤細胞上調FasL的表達就是其中的機制之一。

    FasL是相對分子質量為40×103的Ⅱ型跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子超家族成員，通過與細胞膜受體Fas結合激活Fas介導的死亡信號復合體，終導致細胞凋亡。很多惡性腫瘤細胞包括結腸癌、胃癌、肺癌及腦膠質瘤等自身存在FasL過表達。高表達FasL可能通過誘導細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)和NK細胞凋亡，抑制CTLs和NK細胞由Fas介導的殺傷腫瘤細胞作用，產(chǎn)生所謂腫瘤細胞的“反擊”現(xiàn)象［8-9］。而且，在轉移性腫瘤中，如在乳腺癌淋巴結轉移灶及結腸癌肝轉移灶中，F(xiàn)asL的表達明顯高于原發(fā)灶腫瘤，并通過FasFasL途徑誘導免疫細胞凋亡，從而抑制機體的全身免疫。這說明FasL的表達有利于腫瘤細胞形成新的轉移灶。

    近年研究已證明，幾乎所有惡性實體腫瘤細胞LNR，特別是相對分子質量為67×103的LNR表達上調，與腫瘤轉移密切相關［10-11］。我們前期對LNR表達上調介導膽管癌轉移的分子機制的研究發(fā)現(xiàn)：LNR過表達與臨床膽管癌惡性表型關系密切，主要通過：(1)介導膽管癌細胞與ECM間黏附，激活局部黏附激酶而促進腫瘤的侵襲轉移；(2)通過增強細胞骨架蛋白的表達和在胞質內的重排而增強癌細胞的運動能力；(3)介導蛋白水解酶MMP2、MMP9、uPA的mRNA和蛋白表達，提高腫瘤細胞對ECM的降解；(4)通過激活FAK激酶MAPK信號轉導通路而調節(jié)膽管癌細胞侵襲過程。其次，我們還發(fā)現(xiàn)：當LNR反義寡核苷酸抑制高轉移性膽管癌細胞的LNR過表達，則明顯抑制膽管癌細胞的侵襲能力。李子禹等［12］已經(jīng)在膽管癌細胞株QBC939中證明FasL高表達。

    上述研究提示LNR過表達與膽管癌細胞FasL表達上調可能存在內在聯(lián)系。因此，本研究基于前期研究工作基礎，通過轉染反義LNR寡核苷酸沉默LNR基因的表達，研究LNR是否在膽管癌免疫逃逸中通過FasL來實現(xiàn)的。通過細胞免疫組織化學和RTPCR方法均提示在膽管癌中LNR過表達時FasL的表達異常增高，當將LNR基因沉默后，F(xiàn)asL基因的表達同時也降低。這說明LNR基因表達降低時可導致FasL基因表達相應降低。我們初步認為LNR過表達在膽管癌免疫逃逸中的作用可能是通過FasFasL信號通路實現(xiàn)的。LNR過表達可能激活細胞內信號通路MAPK而調控FasL的基因轉錄，誘導CTLs凋亡，從而促進腫瘤轉移。至于LNR過表達介導的腫瘤細胞金屬蛋白酶是否促進細胞膜表面結合的FasL降解，形成可溶性FasL，干擾機體的免疫識別和攻擊能力，以及LNR過表達具體與FasL啟動子區(qū)域內哪些基因表達有關還有待于進一步研究。

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作者：高占峰 李天宇 高應鴻 蔣衛(wèi)偉 吳虹曄 王曙光

作者單位：400038 重慶，第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院全軍肝膽外科研究所、中國人民解放軍西南肝膽外科醫(yī)院