發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌治療新策略

本研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)LYPLAL1-DT在SCLC耐藥細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)。功能獲得和功能缺失實(shí)驗(yàn)表明，LYPLAL1-DT在體外和體內(nèi)均降低了對cDDP、VP-16或PTX的敏感性。過表達(dá)LYPLAL1-DT可促進(jìn)SCLC細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的分析，包括RIP和RNA pull-down實(shí)驗(yàn)，揭示了LYPLAL1-DT通過吸附miR-204-5p促進(jìn)BCL2的表達(dá)，并與自噬特異性復(fù)合物（BECN1/PtdIns3K復(fù)合物）的組裝有關(guān)。在CDX和PDX模型中，venetoclax和HCQ與cDDP、VP-16或PTX聯(lián)用可有效緩解SCLC細(xì)胞的化療耐藥性，并抑制腫瘤生長，且未誘發(fā)明顯毒性作用。本研究表明維奈托克、羥氯喹聯(lián)合cDDP、VP-16或PTX的三聯(lián)療法可克服難治性SCLC，為對抗SCLC化療耐藥提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

背景信息

 01 

小細(xì)胞肺癌（SCLC）占所有肺癌的13% ~ 15%，是全球癌癥相關(guān)死亡率的第六大原因。SCLC具有倍增時間快、增殖能力強(qiáng)、早期廣泛轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。盡管診斷和治療方法不斷進(jìn)步，但SCLC的預(yù)后仍然很差，主要原因是各種治療藥物的耐藥迅速出現(xiàn)。依托泊苷-鉑類仍然是SCLC常用的初始治療方案。雖然大多數(shù)患者對化療有應(yīng)答，但只有約10%的患者在2年后無病生存，其余患者在一線治療后會出現(xiàn)復(fù)發(fā)。甚至紫杉醇等二線治療也會出現(xiàn)化療耐藥。因此，多藥耐藥（MDR）已成為SCLC治療中重要的問題。

SCLC中MDR的發(fā)生是一個多方面的過程，涉及遺傳、表觀遺傳和微環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用。凋亡和自噬途徑的失調(diào)是這一過程的兩個關(guān)鍵分子因素。凋亡信號的減少，尤其是抗凋亡系統(tǒng)的激活，使癌細(xì)胞逃避化療，導(dǎo)致細(xì)胞失控增殖、腫瘤生存、耐藥和癌癥復(fù)發(fā)。B細(xì)胞淋巴瘤2 （BCL2）水平的異常升高與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后相關(guān)。靶向BCL2失活已成為治療各種類型癌癥有希望的方法之一。小分子BCL2抑制劑ABT-199（商業(yè)名稱為維奈托克）已在慢性白血病、急性髓系白血病和多發(fā)性骨髓瘤中顯示出可觀的臨床療效。研究人員證明，維奈托克可在體內(nèi)誘導(dǎo)高表達(dá)bcl2的SCLC腫瘤消退，這提示維奈托克有可能用于相當(dāng)一部分SCLC病例。然而，基于維奈托克的治療方案也面臨耐藥的困境。

LYPLAL1-DT通過抑制細(xì)胞凋亡降低SCLC細(xì)胞的化療敏感性

 02 

研究人員通過Hoechst染色、流式細(xì)胞術(shù)和caspase 3水平檢測細(xì)胞凋亡，探討了LYPLAL1-DT是否參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。經(jīng)化療藥物處理后，LYPLAL1-DT過表達(dá)組具有典型特征（細(xì)胞核凝集）的凋亡細(xì)胞比例低于對照組，而LYPLAL1-DT敲低組則相反。研究人員通過檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 （caspase 3）的表達(dá)，明確化療后腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑。在cDDP、VP-16和PTX處理下，LYPLAL1-DT過表達(dá)細(xì)胞的caspase 3活性低于對照組，而LYPLAL1-DT敲低細(xì)胞的caspase 3活性高于對照組。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)LYPLAL1-DT過表達(dá)可降低H446細(xì)胞對化療藥物的敏感性。研究表明LYPLAL1-DT通過抑制線粒體凋亡途徑降低SCLC的化療敏感性。

LYPLAL1-DT通過直接靶向miR-204-5p上調(diào)BCL2表達(dá)

 03 

之前的研究表明，miR-204-5p是LYPLAL1-DT的調(diào)控microRNA之一。通過RIP實(shí)驗(yàn)，研究人員證實(shí)了LYPLAL1-DT在miR-204-5p/ago2復(fù)合物中富集。為了確定LYPLAL1-DT/miR-204-5p軸是否在化療藥物治療反應(yīng)中發(fā)揮作用，研究人員評估了miR-204-5p在不同條件下的表達(dá)水平。在H446/cDDP、H446/VP-16和H446/PTX細(xì)胞株中，cDDP、VP-16和PTX處理H446細(xì)胞株后，H446細(xì)胞株中H446的表達(dá)均明顯降低，且呈濃度和時間依賴性。同時過表達(dá)LYPLAL1-DT和miR-204-5p模擬物較LYPLAL1-DT過表達(dá)細(xì)胞存活率低，且呈時間依賴性，而miR-204-5p抑制劑增加了IC50值，恢復(fù)了LYPLAL1-DT敲低引起的細(xì)胞存活率下降。

為了進(jìn)一步探索miR-204-5p的靶基因，研究人員使用5種生物信息學(xué)算法（miRanda、PicTar、TargetScan、miRDB和starba[x]se）預(yù)測其潛在的調(diào)控靶點(diǎn)。過表達(dá)LYPLAL1-DT增加BCL2的表達(dá)。為了驗(yàn)證miR-204-5p是否靶向BCL2的3 ' -UTR，研究人員構(gòu)建了包含BCL2 3 ' -UTR （WT）或結(jié)合位點(diǎn)突變（MUT）的熒光素酶報告基因。共轉(zhuǎn)染miR-204-5p mimics可降低BCL2 WT轉(zhuǎn)染細(xì)胞中BCL2的熒光素酶活性，而對MUT BCL2 3 ' -UTR轉(zhuǎn)染細(xì)胞中BCL2的熒光素酶活性無明顯影響。挽救實(shí)驗(yàn)明確LYPLAL1-DT/miR-204-5p/BCL2在SCLC多藥耐藥中的調(diào)控軸。過表達(dá)LYPLAL1-DT可上調(diào)BCL2的表達(dá)，而miR-204-5p模擬物可部分恢復(fù)上調(diào)的BCL2表達(dá)。過表達(dá)miR-204-5p mimics改善LYPLAL1-DT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抑制。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)和qRT-PCR結(jié)果顯示，BCL2在cDDP、VP-16和ptx耐藥細(xì)胞株中上調(diào)。在化療耐藥患者的腫瘤切片中也觀察到了類似的結(jié)果。而在化療藥物治療下，其增加呈濃度和時間依賴性。CCK-8結(jié)果顯示，在cDDP處理下，沉默BCL2后，H446/cDDP細(xì)胞的活力和IC50降低。綜上所述，研究數(shù)據(jù)證實(shí)了LYPLAL1-DT通過抑制miR-204-5p上調(diào)BCL2的表達(dá)，從而促進(jìn)SCLC細(xì)胞的多藥耐藥。

結(jié)論

 04 

綜上所述，研究人員發(fā)現(xiàn)上調(diào)LYPLAL1-DT通過LYPLAL1-DT/miR-204-5p/BCL2軸抑制細(xì)胞凋亡，并通過促進(jìn)PtdIns3K復(fù)合體的組裝促進(jìn)自噬，從而介導(dǎo)SCLC的多藥耐藥。維奈托克、羥氯喹聯(lián)合cDDP、VP-16或PTX三聯(lián)療法可克服難治性SCLC，尤其是在LYPLAL1-DT高表達(dá)的患者中。本研究揭示了SCLC化療耐藥的新的分子機(jī)制，為臨床試驗(yàn)提供了新的治療方法，為SCLC的治療提供了一條有希望的道路。