TPD藥物組學研究中設(shè)置樣本實驗重復的必要性

前言：基于蛋白質(zhì)組學中的數(shù)據(jù)非依賴采集（Data Independent Acquisition，DIA）模式實現(xiàn)對不同蛋白的相對定量，可用于探究靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation，TPD）藥物的靶向特異性，及潛在脫靶風險。為有效監(jiān)測差異蛋白變化，采用合理的實驗設(shè)計、嚴謹?shù)慕y(tǒng)計方法進行組學數(shù)據(jù)挖掘是不可缺少的環(huán)節(jié)。在此，本文主要討論TPD藥物組學中設(shè)置有效、合理的實驗重復的必要性。（DOI: 10.1007/ 978-1-0716-1024-4_1）。

1. 蛋白組學研究中的實驗重復分類

實驗設(shè)計對實驗結(jié)果可靠性起著決定性作用，尤其在蛋白質(zhì)組項目中，合理的實驗重復設(shè)計至關(guān)重要。目前來說，實驗重復類型主要包括生物學重復和技術(shù)重復。不同實驗設(shè)計，其生物學重復和技術(shù)重復的定義存在差異，因此本文基于TPD藥物處理前后的細胞樣本進行描述，TPD組學的生物學重復是指同一個實驗組別中獨立制備的樣本個數(shù)，例如藥物A設(shè)置3個生物學重復，指的是對3份相同來源的細胞樣本進行相同的給藥處理；TPD組學的技術(shù)重復是指對同一個生物學樣本進行多次重復技術(shù)檢測，例如3次技術(shù)重復是指同一個生物學重復的樣本進行3次質(zhì)譜檢測。在TPD組學實驗中，生物學重復會帶來較明顯的給藥前后的細胞生物差異結(jié)果，但質(zhì)譜多次技術(shù)重復采集的差異程度極小，因此在TPD組學中一般不對技術(shù)重復做要求。

通常生物學重復用于概括性結(jié)論的說明，技術(shù)重復用于減少這些結(jié)論的變異性。同時采用生物學重復與技術(shù)重復可以使得實驗設(shè)計更加嚴謹，實驗結(jié)果更加可靠。但根據(jù)TPD組學的實驗特點，建議對藥物處理前后的細胞樣本設(shè)計有效的生物學重復，一般不對技術(shù)重復做要求。

2. 設(shè)置實驗重復的必要性

2.1 文章發(fā)表及項目申報要求

目前蛋白質(zhì)組學領(lǐng)域主流的雜志如MCP (Molecular & Cellular Proteomics)，JPR (Journal of Proteomeresearch)，Proteomics，JP (Journal of Proteomics)等對于大規(guī)模蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)的嚴謹性都有非常高的要求，對于沒有生物學重復以及技術(shù)重復的組學結(jié)果概不接收，并且都要求在正文或者補充數(shù)據(jù)中寫明實驗設(shè)計以及數(shù)據(jù)分析的細節(jié)，因此建議用于科學研究的實驗設(shè)計至少采取3次生物學重復。

此外，若TPD組學實驗結(jié)果用于藥物申報，需要根據(jù)《體外診斷試劑臨床實驗指導原則》中低樣本量的要求。參考對應的指導原則，可采用統(tǒng)計學公式計算所需樣本量。

2.2 統(tǒng)計學要求

TPD研究中涉及通過蛋白質(zhì)組學分析差異蛋白。一般來說，只有當樣本生物學重復達到3個及以上時，才能夠用于進行較為可信的檢驗，并且結(jié)果可信度隨著樣本重復的增加而增加。檢驗用于推斷實驗組與對照組是否有差異，以及這種差異。差異蛋白分析需要結(jié)合差異倍數(shù)的計算以及分析對數(shù)據(jù)進行篩選，只有符合篩選標準的蛋白才被認為是可信的上下調(diào)蛋白。

此外，統(tǒng)計學中功效一般是針對效應值（量化現(xiàn)象強度的數(shù)值）而言，也就是在統(tǒng)計推斷中檢測出某個效應值的把握，可以看作真實效應發(fā)生的概率。嘉華藥銳通過整合眾多組學數(shù)據(jù)，得到了理論上的真實效應發(fā)生概率和生物學重復的關(guān)系（細胞樣本）。如圖所示，當生物學重復為1時，此時功效為0；而功效會隨著生物學重復數(shù)據(jù)增加而增加，當接近大于等于15個時，功效接近1。其中，當生物學重復由2個增加至3個時，功效增幅大；當生物學重復由3逐步增加時，功效的增幅逐步降低。當每組3個生物學重復時，真實事件發(fā)生的概率已經(jīng)能夠達到數(shù)據(jù)分析要求。綜合考慮到數(shù)據(jù)可信度，及實驗成本問題，一般實驗建議選擇3個生物學重復。一般來說，若TPD組學數(shù)據(jù)用于臨床生物標志物發(fā)現(xiàn)等大隊列樣本研究中，則需要更多的重復，其數(shù)據(jù)可信度才能達到臨床生物標志物發(fā)現(xiàn)標準。

功效與生物學重復關(guān)系圖（細胞樣本）

2.3 準確定量特定蛋白

TPD蛋白組學是高通量的數(shù)據(jù)集，能夠精確地展示蛋白整體穩(wěn)態(tài)的變化。但由于TPD組學相對定量的特點，在對中低豐度，尤其低豐度蛋白進行相對定量時，會因肽段強度過低導致質(zhì)譜監(jiān)測可能會出現(xiàn)偏差。因此，相同處理組建議3個及以上的生物學重復，能夠有效的提高蛋白定量的準確性。尤其在判斷TPD藥物處理前后的異常蛋白、或潛在脫靶蛋白時，3個及以上的生物學重復能夠提供有效的參考價值。

綜上所述，通過蛋白質(zhì)組學探究TPD藥物的靶向特異性，及潛在脫靶問題過程中，應根據(jù)實驗特點、分析標準采用合適的實驗重復。在基于TPD藥物處理前后的細胞樣本的組學實驗中，通常建議設(shè)置3個及以上的生物學重復。