聚焦遺傳病基因檢測(cè)，細(xì)說(shuō)全外和醫(yī)學(xué)全外檢測(cè)的臨床應(yīng)用

白化病、血友病、紅綠色盲、佝僂病...這一個(gè)個(gè)單基因遺傳病的背后實(shí)則隱藏了無(wú)數(shù)患者家庭的痛苦。在2012年的《中國(guó)出生缺陷防治報(bào)告》中提到[1]，我國(guó)出生缺陷發(fā)生率在5.6%左右，每年將新增90萬(wàn)的新生缺陷兒。在各種導(dǎo)致出生缺陷的原因中，單基因遺傳病占有相當(dāng)比例。強(qiáng)調(diào)了單基因遺傳病的診斷和預(yù)防不容小視。

一、怎樣理解單基因遺傳病？

所謂單基因遺傳病，是指受一對(duì)等位基因控制，能夠穩(wěn)定遺傳的先天性疾病。也就是說(shuō)，僅一個(gè)基因的變異就能夠?qū)е录膊〉陌l(fā)生。現(xiàn)階段，已經(jīng)明確了將近一萬(wàn)種單基因遺傳病，并且每年仍在持續(xù)增多中。

單基因遺傳病具有哪些發(fā)病特點(diǎn)？

發(fā)病率低，整體發(fā)病率約為1/100；

傷害性大，單基因遺傳病會(huì)致死、致殘、致畸率高；

治療率低，僅5%的疾病有治療藥物，且費(fèi)用昂貴；

遺傳模式多，具備一定的遺傳特征，如伴性遺傳，遺傳概率多樣；

涉及范圍廣，正常人也可能攜帶致病基因突變（隱性遺傳攜帶者）。

單基因遺傳病具有哪些遺傳方式？

常染色體顯性遺傳（AD）：攜帶即患病，遺傳與性別無(wú)關(guān)，男女發(fā)病機(jī)會(huì)均等；

常染色體隱性遺傳（AR）：遺傳自父母雙方突變才患病，與性別無(wú)關(guān)，男女發(fā)病機(jī)會(huì)均等；

伴X連鎖顯性遺傳（XLD）：攜帶即患病，母親遺傳兒子和女兒，父親只遺傳女兒；

伴X連鎖隱性遺傳（XLR）：女兒同時(shí)遺傳父母雙方突變才患病，母親患病兒子也患??；

伴Y連鎖遺傳（Y-li[x]nk）：父系遺傳，只發(fā)生在男性，且在男性家系中世代遺傳；

線粒體遺傳（mtDNA）：母系遺傳，母親遺傳給子女，且在女性家系中世代遺傳。

針對(duì)單基因遺傳病的診斷，傳統(tǒng)上依賴(lài)于系譜分析、生化、影像等手段評(píng)估，但由于疾病間的共性，導(dǎo)致精度不佳，往往出現(xiàn)誤診、漏診的可能，并且診斷周期長(zhǎng)。近年來(lái)，Sanger、NGS等分子診斷技術(shù)通過(guò)基因?qū)用?，為遺傳病提供了更精的診斷依據(jù)，成為其主要輔助診斷方式。與此同時(shí)，基因檢測(cè)還能為一些遺傳病的預(yù)后危險(xiǎn)分層、治療策略制定、遺傳篩查以及選擇性生育等方面有深刻的指導(dǎo)意義。

二、全外顯子組和醫(yī)學(xué)全外檢測(cè)如何應(yīng)用于遺傳病診斷？

目前，已證實(shí)，人類(lèi)基因組編碼2萬(wàn)多個(gè)基因，每個(gè)基因都包含基因的外顯子（exon）和內(nèi)含子（intron）兩個(gè)區(qū)域，兩者相互交錯(cuò)。其中，外顯子僅占比10%，編碼氨基酸翻譯成功能性蛋白質(zhì)，涵蓋了與個(gè)體表型相關(guān)的大部分功能性變異。外顯子區(qū)的致病性變異往往被認(rèn)為與蛋白質(zhì)的功能改變直接相關(guān)，且能夠覆蓋85%以上的單基因遺傳病。而內(nèi)含子則不編碼蛋白質(zhì)，更多的是參與基因表達(dá)的調(diào)控，對(duì)功能改變影響較小。因此，通過(guò)全外顯子組檢測(cè)編碼蛋白的基因突變，能夠較全面地從根本上明確患者的致病原因和遺傳風(fēng)險(xiǎn)。

那么，什么是全外顯子組檢測(cè)（Whole Exome Sequencing，WES）和醫(yī)學(xué)全外顯子組檢測(cè)（Medical WES，mWES）？

所謂全外顯子組檢測(cè)，顧名思義，就是指檢測(cè)人類(lèi)2萬(wàn)多個(gè)基因的全部外顯子區(qū)域，覆蓋合成蛋白質(zhì)所需要的重要信息，分析基因外顯子，找到與表型相關(guān)的基因突變。而醫(yī)學(xué)外顯子組檢測(cè)（mWES），也是屬于全外顯子檢測(cè)的范疇，只是將OMIM等數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道已經(jīng)確認(rèn)的致病基因，大約5000個(gè)，放在一起，檢測(cè)這些基因的全部外顯子。因此，相對(duì)而言，mWES策略更像是WES檢測(cè)的縮小聚焦版，包含的是檢測(cè)基因數(shù)目較少，成本也相對(duì)低廉。

自然而然，相對(duì)于mWES而言，WES能夠在其基礎(chǔ)上，擴(kuò)大檢測(cè)范圍，能有機(jī)會(huì)發(fā)現(xiàn)新的候選致病基因。尤其對(duì)于那些臨床表型復(fù)雜、表型不特異、診斷不明或表型展示不全的患者，WES是更為理想的檢測(cè)手段。而且像這些臨床表型診斷困難的患者，通過(guò)一家三口同步行WES檢測(cè)，分析家系成員與基因突變的遺傳連鎖關(guān)系，會(huì)提高部分突變的致病性證據(jù)，對(duì)患者致病基因的查找及疾病的確診更具優(yōu)勢(shì)，也有助于臨床的科研探索！關(guān)于全外顯子檢測(cè)和醫(yī)學(xué)全外顯子檢測(cè)的詳細(xì)區(qū)別.

三、全外顯子/醫(yī)學(xué)全外檢測(cè)遺傳病有什么不足？

隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，全外顯子組檢測(cè)采用的NGS技術(shù)可同時(shí)實(shí)現(xiàn)大量靶基因檢測(cè)及多種遺傳病的分析，實(shí)現(xiàn)了省時(shí)和便捷的檢測(cè)策略，滿足檢測(cè)基因的單核苷酸變異（SNV）、小片段變異（indel）及基因擴(kuò)增（CNV）等?？梢詽M足絕大部分遺傳病病因查找的基本需求。但由于技術(shù)方法學(xué)的限制，確實(shí)存在一些特殊的變異類(lèi)型或同源基因的檢測(cè)，單純依靠NGS檢測(cè)還不夠，需要全外顯子聯(lián)合其他方法學(xué)檢測(cè)。在此，我們結(jié)合指南舉出典型案例。

在2019版《罕見(jiàn)病診療指南》中提到[2]，以下多種單基因遺傳病除了在全外顯子檢測(cè)之外，仍需采用MLPA檢測(cè)基因大片段變異，進(jìn)一步提高變異的檢出率。包括遺傳性痙攣性截癱（SPAST基因）、天使綜合征（UBE3A基因）、腓骨肌萎縮癥（PMP22基因）、肝豆?fàn)詈俗冃裕?/span>ATP7B基因）、波伊茨-耶格綜合征（STK11基因）、進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD基因）、囊性纖維化（CFTR基因）、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（RB1基因）、脊髓性肌萎縮癥（SMA基因）等。

在脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)的診斷中，致病原因?yàn)榛虻膭?dòng)態(tài)突變，動(dòng)態(tài)突變類(lèi)型需借助PCR-毛細(xì)管電泳方法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確檢測(cè)?！哆z傳性共濟(jì)失調(diào)診斷與治療專(zhuān)家策略》中明確[3]，需要通過(guò)PCR-毛細(xì)管凝膠電泳等方法確定AXTN3、AXTN2、AXTN1等基因編碼序列中CAG的重復(fù)數(shù)，進(jìn)行疾病的確診和亞型判別。而X-連鎖共濟(jì)失調(diào)是由Xq27.3的FMR1基因內(nèi)CGG三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增所致，重復(fù)次數(shù)55—200次者稱(chēng)為前突變（premutation），具有不完全外顯率，若重復(fù)次數(shù)>200次則導(dǎo)致遺傳性智力障礙的脆性X綜合征。

在常染色體顯性多囊腎（ADPKD）中，主要基因PKD1存在序列同源性極高的假基因（假基因是指與已知功能基因序列相似，但不產(chǎn)生有功能產(chǎn)物的基因），這時(shí)WES檢測(cè)對(duì)假基因的區(qū)分有難度，需要長(zhǎng)片段PCR（Long range PCR）等其他方法學(xué)進(jìn)行區(qū)分。在《多囊腎病的臨床實(shí)踐指南》基因篩診斷及篩查部分明確提到[4]，目前主要采用長(zhǎng)片段PCR＋NGS技術(shù)對(duì)ADPKD患者進(jìn)行突變檢測(cè)，PKD基因突變的檢出率約為90%，仍有10%的突變無(wú)法檢出，可能還需要MLPA等方法學(xué)排查大片段變異。

因此，事實(shí)上，每種單基因遺傳病在分子發(fā)病機(jī)制上都具有其自身獨(dú)特特點(diǎn)?；诓煌椒▽W(xué)各有所長(zhǎng)，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，采用多種方法學(xué)聯(lián)合檢測(cè)，能夠全面分析分子異常致病機(jī)制，也是遺傳病分子檢測(cè)的發(fā)展方向。為此，我們結(jié)合文獻(xiàn)[5]，講解部分檢測(cè)技術(shù)的特點(diǎn)。另外，針對(duì)特定遺傳病的檢測(cè)方案見(jiàn)文末。

四、遺傳病檢測(cè)為什么需要提供全面的表型診斷？

首先，全外顯子組基因檢測(cè)全面覆蓋了人類(lèi)2萬(wàn)多個(gè)基因，包含了受檢者所有的突變，那么檢出的突變數(shù)目數(shù)以萬(wàn)計(jì)，需要結(jié)合患者的具體表型來(lái)進(jìn)行篩選致病基因，如同大海撈針。因此，提供全面明確的臨床表型，尤其是典型的臨床表型，是WES檢測(cè)分析的重要前提！否則，模糊或者錯(cuò)誤的表型提供，則勢(shì)必干擾分析方向和準(zhǔn)確度[6]。

例如，發(fā)育遲緩是一個(gè)表型，但不具體，因?yàn)榘l(fā)育遲緩包括表現(xiàn)為智力障礙的精神發(fā)育遲緩，和身材矮小的肢體發(fā)育遲緩，還有說(shuō)話遲鈍的語(yǔ)言發(fā)育遲緩，抑或表現(xiàn)多發(fā)的多種發(fā)育遲緩，單單一個(gè)發(fā)育遲緩就涉及到運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多系統(tǒng)因素。那么這就是基因分析和解讀的多個(gè)不同方向。而在解讀分析端，實(shí)在是不怕前途坎坷，就怕方向找錯(cuò)！

所以，遺傳病檢測(cè)提供表型要盡量具體化，好指向典型因素，提供具有決定性意義的特征表型。諸如上述患者，包括基本的身材表現(xiàn)、粗大動(dòng)作和精細(xì)動(dòng)作發(fā)育情況、生活適應(yīng)能力、語(yǔ)言和社交行為能力的發(fā)展情況等，提供得越全越有利于檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2020年，發(fā)表在中華醫(yī)學(xué)雜志的述評(píng)《中國(guó)人群遺傳病基因型與表型數(shù)據(jù)庫(kù)的建立對(duì)遺傳病精診斷的重要性》中就提到[7]，遺傳變異的精解讀需借助于基因型數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)，充分的表型信息將提高數(shù)據(jù)分析和變異解讀的準(zhǔn)確性。通過(guò)完善表型數(shù)據(jù)，促進(jìn)基因型和表型數(shù)據(jù)的均衡發(fā)展，更加有利于遺傳病的診斷。實(shí)驗(yàn)室需同臨床醫(yī)生良好溝通獲得準(zhǔn)確的表型信息，為提交高質(zhì)量的表型數(shù)據(jù)提供保證。

五、為什么器官移植的患者也要做遺傳病全外顯子檢測(cè)？

作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重大進(jìn)步之一，器官移植工作使得很多因器官衰竭而危及生命的患者重獲新生。如今，我國(guó)器官移植數(shù)量已經(jīng)躍居全球第2位。目前移植術(shù)后排斥反應(yīng)、原發(fā)病復(fù)發(fā)等是器官移植患者的關(guān)鍵問(wèn)題。

研究證實(shí)，有明確遺傳因素的患者和非遺傳性患者移植后的復(fù)發(fā)率不同，移植前基因檢測(cè)可以評(píng)估復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，也可為患者提供更個(gè)體化的治療方法，有機(jī)會(huì)避免免疫抑制劑的使用從而防止相關(guān)不良反應(yīng)。我們以臨床相對(duì)常見(jiàn)的腎臟移植來(lái)舉例。

根據(jù)臨床數(shù)據(jù)[8]，29.1%的激素耐藥型腎病綜合征（SRNS）患兒有明確的單基因突變。一項(xiàng)納入1655例腎病患者（其中約80%為兒童患者）[9]，常見(jiàn)的病理診斷為局灶節(jié)段性腎小球硬化（56％），微小病變（21％）及系膜增生性腎小球腎炎（12%）。Alport綜合征、脂蛋白腎病、多囊腎等單基因遺傳病，都可能是導(dǎo)致這些疾病的原因。這提示移植科醫(yī)師在評(píng)估病理類(lèi)型為上述癥狀的患者時(shí)，應(yīng)考慮其遺傳的可能性。因此，親屬活體供腎是一種重要且謹(jǐn)慎的選擇，遺傳性腎病的家庭成員在活體移植前都應(yīng)接受基因檢測(cè)。如果遺傳方式為AD，若沒(méi)有排除家庭成員也存在基因突變的情況，不應(yīng)將其視為活體親屬供體候選。若遺傳方式為AR，也存在多種不穩(wěn)定風(fēng)險(xiǎn)。

國(guó)際兒科腎臟病協(xié)會(huì)強(qiáng)調(diào)[10]，如有可能，建議對(duì)候選活體腎移植供者行基因檢測(cè)評(píng)估是否存在SRNS遺傳背景（X，強(qiáng)推）。在排除COL4A等致病性雜合缺陷的供者后，攜帶其他隱性變異的親屬在進(jìn)行遺傳咨詢(xún)并在取得完全知情同意后，才可考慮作為潛在的供者。不建議將顯性基因致病變異或可能致病變異攜帶者（無(wú)論是否有癥狀）作為腎移植供者（X，強(qiáng)推）。

除了預(yù)后復(fù)發(fā)指導(dǎo)之外，在腎移植術(shù)后用藥上，他克莫司（Tacrolimus，FK506）作為一種有效的免疫抑制藥物，是腎移植術(shù)后免疫維持方案的基礎(chǔ)用藥之一。通過(guò)藥物基因組學(xué)證實(shí)[11]，CYP3A5蛋白是影響他克莫司代謝的關(guān)鍵酶，CYP3A5基因6986 A/G是CYP3A5常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)GG基因型（CYP3A5 *3/*3）表現(xiàn)為他克莫司代謝性慢，降壓效果好，AG組（CYP3A5 *1/*3）次之，AA組（CYP3A5 *1/*1）較差。目前，國(guó)內(nèi)外相關(guān)指南均推，要達(dá)到相同的藥物濃度，攜帶有CYP3A5*1/*1或CYP3A5*1/*3基因的患者比CYP3A5*3/*3需要更大的藥物劑量，甚至可達(dá)兩倍以上。因此，通過(guò)精高效的分子診斷技術(shù)，在用藥前進(jìn)行CYP3A5基因分型檢測(cè)，可指導(dǎo)臨床針對(duì)特定的患者選擇合適的藥物和給藥劑量，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥，從而提高藥物治療的有效性和安全性，防止嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。

總結(jié)來(lái)說(shuō)，通過(guò)本文在單基因遺傳病，全外顯子/醫(yī)學(xué)全外顯子檢測(cè)，遺傳病其他方法學(xué)檢測(cè)，以及器官移植前的遺傳病檢測(cè)等知識(shí)點(diǎn)上的細(xì)致講解，相信您對(duì)遺傳病的發(fā)生機(jī)制和檢測(cè)意義都有了充分的認(rèn)識(shí)。