LNP共遞送mRNA和siRNA→PD1lo CAR-T細(xì)胞

PD-1信號通路是腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞活性減弱的主要來源。雖然抑制PD-1通路的臨床方法（如抗體阻斷）已經(jīng)取得了廣泛的成功，但這些方法導(dǎo)致了廣泛的PD-1抑制，增加了自身免疫反應(yīng)的風(fēng)險。賓夕法尼亞大學(xué) Michael Mitchell 教授團(tuán)隊聯(lián)合CAR-T細(xì)胞療法先驅(qū) Carl June 教授和mRNA技術(shù)先驅(qū)  Drew Weissman 教授，報道了一種LNP平臺的發(fā)展，用于同時在T細(xì)胞中實現(xiàn)治療基因表達(dá)和RNA干擾（RNAi）介導(dǎo)的暫時性基因敲低。在開發(fā)這個平臺時，觀察到兩種RNA貨物在共同封裝時有趣地相互作用，相比單獨(dú)傳遞貨物提高了表達(dá)和敲低特性。這種mRNA/小干擾RNA（siRNA）共遞送平臺被采用來向人原代T細(xì)胞外遞送到CAR mRNA和靶向PD-1的siRNA，并且觀察到了強(qiáng)烈的CAR表達(dá)和PD-1敲低而沒有明顯的整體T細(xì)胞激活狀態(tài)變化。這種遞送平臺顯示出巨大的潛力，可以臨時調(diào)節(jié)免疫基因，包括開發(fā)改進(jìn)的腫瘤免疫療法在內(nèi)的許多免疫工程應(yīng)用。

CAR-T細(xì)胞療法近年來作為對抗癌癥和其他疾病的有力工具，在臨床實踐中不斷獲得認(rèn)可。CAR-T療法已被批準(zhǔn)用于治療ALL、B細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤，并正在研究用于NSCLC、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、HIV、心臟損傷等。CAR-T療法的強(qiáng)大效果的一個主要來源是這些療法能夠利用患者的自身免疫系統(tǒng)發(fā)起針對癌細(xì)胞的復(fù)雜進(jìn)攻。然而，CAR-T療法作為免疫系統(tǒng)的延伸意味著工程化的CAR-T細(xì)胞容易受到腫瘤微環(huán)境（TME）中免疫抑制信號的影響，從而阻礙CAR-T療法的效果。

PD-1信號通路已被確立為T細(xì)胞活性在TME中的主要抑制者，包括在接受CAR-T細(xì)胞療法時。PD-1（CD279），一種免疫檢查點受體，在激活的T細(xì)胞表面表達(dá)。當(dāng)與其中一種配體（PD-L1或PD-L2）結(jié)合時，PD-1會啟動免疫抑制反應(yīng)，通過促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞的凋亡和抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的凋亡來遏制炎癥性T細(xì)胞活性。雖然PD-L2的表達(dá)相對有限，但PD-L1在各種腫瘤中過度表達(dá)，并被認(rèn)為在免疫逃逸方面起著重要作用，特別是降低CAR-T細(xì)胞的功效。因此，抑制PD-1和PD-L1之間的相互作用作為恢復(fù)CAR-T細(xì)胞功效的潛在手段引起了極大的興趣。

通過阻斷抗體阻斷PD-1及其配體是克服免疫抑制PD-1通路的一種廣泛使用的臨床策略。雖然將阻斷性抗體與CAR-T細(xì)胞療法結(jié)合是一種有效的方法，但抗體的給藥會導(dǎo)致PD-1信號傳導(dǎo)的廣泛抑制，從而可能導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)。CAR-T療法對自體T細(xì)胞進(jìn)行工程改造以表達(dá)外源性CAR，因此有可能通過靶向PD-1抑制來產(chǎn)生具有抑制PD-1信號傳導(dǎo)的CAR-T細(xì)胞，同時在其他地方保留PD-1通路。這種方法是在CAR工程的同時破壞PD-1通路，并已通過幾種方法進(jìn)行了研究，包括使用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的PD-1敲除、整合工程化的抗PD-1 scFv和表達(dá)針對PD-1的短發(fā)夾RNA(shRNA)等。然而，大多數(shù)這些方法都依賴于通過病毒基因遞送和/或CRISPR-Cas9基因編輯改變基因組。這意味著這些PD-1抑制措施，創(chuàng)建出對這種抗炎信號通脫敏的T細(xì)胞，為自身免疫反應(yīng)打開大門。然而，T細(xì)胞配備內(nèi)源性的遺傳轉(zhuǎn)錄瞬時抑制機(jī)制，即RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)。因此，在轉(zhuǎn)錄水平上使用RNA干擾（RNAi）暫時破壞PD-1信號通路提供了一種吸引人且未充分探索的替代當(dāng)前方法的選擇。

該賓夕法尼亞團(tuán)隊報告了一種非病毒平臺的發(fā)展，該平臺通過使用LNPs遞送CAR編碼的mRNA，用于生產(chǎn)短暫的CAR-T細(xì)胞。在本研究中，將這一平臺增強(qiáng)，以實現(xiàn)外源性mRNA的同時表達(dá)和使用RNAi任意內(nèi)源基因的臨時中斷。使用工程化的LNP平臺在體外向T細(xì)胞傳遞CAR mRNA和針對PD-1的siRNA，生成具有強(qiáng)大但短暫CAR表達(dá)和暫時細(xì)胞內(nèi)在PD-1中斷的人T細(xì)胞。這些“超級”CAR-T細(xì)胞，在完成其功能后，可以恢復(fù)到正?；颊?/span>T細(xì)胞的功能，極大地限制了由于CAR表達(dá)和PD-1抑制引起的脫靶效應(yīng)的范圍。結(jié)果顯示由于共同封裝導(dǎo)致的mRNA和siRNA貨物之間的有趣相互作用，這表明即使在不需要基因沉默的應(yīng)用中，siRNA的納入可能對LNP介導(dǎo)的mRNA遞送有益。

可電離脂質(zhì)合成和LNP配方

為了開發(fā)用于T細(xì)胞共同傳遞mRNA和siRNA的LNPs，制備了含有四種主要脂質(zhì)成分的LNPs。這些成分包括可離子化脂質(zhì)，對于內(nèi)體逃逸和貨物釋放到胞質(zhì)中至關(guān)重要；“輔助”磷脂，有助于封裝和LNP膜形成；膽固醇，為膜穩(wěn)定性與融合提供支持；以及錨定在脂質(zhì)上的PEG，延長循環(huán)時間并限制與固有免疫系統(tǒng)的相互作用。本研究的所有LNP配方中都使用了新型離子化脂質(zhì)C14-494，之前被稱為“C14-4”，因為先前已證明這種脂質(zhì)的LNPs在體外和體內(nèi)具有強(qiáng)大的mRNA遞送能力。為了生產(chǎn)C14-494離子化脂質(zhì)，將494多胺核心與過量的14碳烷基環(huán)氧尾部反應(yīng)，產(chǎn)品鑒定和純度通過LC-MS得到確認(rèn)。在這項研究中，調(diào)查了兩種“輔助”脂質(zhì)：DOPE，它通常用于mRNA遞送的LNP配方中；以及DSPC，歷史上用于siRNA封裝。為了制備LNPs，在乙醇中混合所有脂質(zhì)成分，并與包含mRNA和/或siRNA的水性溶液混合，使用微流控設(shè)備進(jìn)行混合，該設(shè)備由交錯的魚骨攪拌器制成。制備后，使用標(biāo)準(zhǔn)方法表征了LNP的親水尺寸、多分散度、zeta電位、離子化性和RNA包裹。觀察到LNP的pKa值介于5和7之間，表明其在晚期內(nèi)體中的可離子化特性。LNPs通常是單分散的，直徑通常低于100nm。

用于體外雙重RNA遞送的賦形劑組合的篩選

為了開發(fā)雙RNA遞送到T細(xì)胞的LNPs首先調(diào)整LNPs的組成以容納混合貨物的mRNA和siRNA。為此，設(shè)計了一個庫的LNPs與輔料組合的變化沿從“siRNA樣”的“mRNA樣”的連續(xù)性基于先前的研究【Lipid Nanoparticle Formulations for Enhanced Co-delivery of siRNA and mRNA】。雖然這項之前的研究確定了輔料組成的共同傳遞的mRNA和siRNA，交付優(yōu)化可能會根據(jù)細(xì)胞類型和離子化脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，因為離子化脂質(zhì)結(jié)構(gòu)已被證明對LNPs的轉(zhuǎn)染特性產(chǎn)生影響，和新型離子化脂C14-494比以前研究過的離子化脂為雙重RNA遞送具有實質(zhì)上不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

為了研究賦形劑組成對體外RNA共遞送到T細(xì)胞的影響，將編碼mCherry的mRNA和靶向EGFP的siRNA共包封在不同賦形劑成分的LNP中。表征顯示，對于模擬，“siRNA樣”制劑中的LNP流體動力學(xué)直徑通常高于“mRNA樣”制劑。所有觀察到的z-平均直徑都在150nm以下，幾乎所有的多分散指數(shù)（PDI）都在0.3以下。值得注意的是，RNA包裹在包含DOPE的配方中要高得多——只含有DSPC作為磷脂的配方W1顯示了63.8％±1.0％的包裹效率，而所有其他配方都顯示出了至少88％的平均包裹效率。特別是，配方W4和W5，“mRNA樣”的配方，實現(xiàn)了高達(dá)97％的平均包裹效率，并且其封裝的RNA濃度約為配方W1的6倍。配方W1的ζ電位適度為負(fù)（平均值為-13.9mV），這可能是由于其相對較差的RNA封裝，但隨著包裹效率的提高，ζ電位逐漸變得更加積極，達(dá)到配方W5的輕微正電位（平均值為6.35mV）。

為了方便起見，使用Jurkat細(xì)胞對T細(xì)胞核酸共遞送進(jìn)行研究，Jurkat是一種的永生化人類T細(xì)胞系，通常用于免疫模型。用含有mCherry mRNA和EGFP siRNA的LNP以每100000個細(xì)胞50ng的包封mRNA的劑量處理穩(wěn)定表達(dá)EGFP的Jurkat細(xì)胞。1天后，使用流式細(xì)胞術(shù)分別量化mCherry和EGFP熒光作為mRNA遞送和siRNA遞送的測量，并使用熒光顯微鏡進(jìn)行二次確認(rèn)。通過比較未經(jīng)處理的EGFP+Jurkat細(xì)胞和未經(jīng)處理的野生型（EGFP-）Jurkat細(xì)胞來量化EGFP敲低。評估mCherry表達(dá)為陽性率，通過比較未經(jīng)處理的野生型Jurkat細(xì)胞。這個篩選確定了配方W4和W5作為在體外介導(dǎo)mRNA和siRNA的大功能遞送，mCherry陽性率為91.4%±5.1%和90.5%±5.0%，明顯的EGFP敲低量分別為26.3%±2.8%和30.1%±3.9%。重要的是，蛋白組學(xué)測量的EGFP敲低可能低估了siRNA遞送的實際轉(zhuǎn)錄組效應(yīng)；然而，這僅影響定量，并不妨礙將蛋白組學(xué)測量作為相對siRNA遞送的替代方法。由于配方W5具有優(yōu)越的敲低特性，兩個領(lǐng)先配方之間的mRNA遞送無法區(qū)分，以及配方W5的相對簡單性（只包含四種輔料，而配方W4則包含五種輔料），選擇配方W5的輔料組成進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

核酸貨物組成對體外雙重RNA遞送的影響

之前的研究表明，在mRNA和siRNA共轉(zhuǎn)染時，每種核酸的存在和相對數(shù)量可能會影響另一種核酸的遞送。為了研究貨物組成對遞送的影響，設(shè)計并制備了包含固定量mCherry mRNA但EGFP siRNA可變量的LNPs，以及僅含EGFP siRNA的siRNA對照。表征結(jié)果顯示這些LNPs具有通常有利的物理化學(xué)特性，所有z平均直徑觀察到低于100nm，且一般略帶正電荷。然后，用這些LNPs來轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)EGFP的Jurkat細(xì)胞。為了探究相對mRNA量對siRNA遞送的影響，在固定劑量為每個100000個細(xì)胞2ng siRNA的情況下處理細(xì)胞。為了研究相對siRNA量對mRNA遞送的影響，分別在固定劑量為每個100000個細(xì)胞33.3ng mRNA的情況下單獨(dú)處理細(xì)胞。24h后，通過流式細(xì)胞術(shù)測量mCherry和EGFP熒光，并通過與未經(jīng)處理的EGFP+和野生型Jurkat細(xì)胞進(jìn)行比較，確定陽性率和敲低量，并通過熒光顯微鏡確認(rèn)轉(zhuǎn)染。有趣的是，mRNA含量似乎適度影響siRNA介導(dǎo)的敲除，與siRNA對照組LNP X6相比，適量的額外mRNA增強(qiáng)了LNPs的抑制作用。

具體來說，siRNA對照配方X6在固定劑量為每100000個細(xì)胞2ng的siRNA下，顯示出EGFP敲低率為15.4%±7.9%，而含有mRNA的配方X3顯示了29.2%±5.4%的EGFP敲低率。同樣地，增加siRNA含量提高了mRNA遞送到某一程度，之后額外的siRNA對mRNA表達(dá)的影響很小，與先前的報告一致。mRNA對照配方X1實現(xiàn)了39.9%±12.7%的mCherry轉(zhuǎn)染，而含有siRNA的配方X3在固定劑量為每100000個細(xì)胞33.3ng的mRNA下，實現(xiàn)了的92.4%±7.5%的轉(zhuǎn)染。配方X3是用mRNA:siRNA重量比為25:3制備的，并顯示出所有測試配方中大的敲低和大的mRNA表達(dá)，因此在這項研究中脫穎而出，成為T細(xì)胞共遞送的LNP領(lǐng)先配方，并作為治療RNA封裝LNPs的基礎(chǔ)。

人原代T細(xì)胞體外PD-1敲低的動力學(xué)

為了驗證PD-1敲低在人原代細(xì)胞中經(jīng)PD-1 siRNA處理后的效果，并確定后續(xù)研究適用的條件，進(jìn)行體外PD-1敲低動力學(xué)研究。將易于獲取的EGFP mRNA作為CAR mRNA的動力學(xué)研究替代品。使用通過體外篩選確定的輔料組成和核酸比（配方X3），在LNPs中將