DNA損傷修復(fù)通路的新選擇

DNA雙鏈斷裂 （DNA double-strand break，DSB） 是一種常見且高度有害的DNA損傷形式，嚴(yán)重威脅著基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞存活。DSB修復(fù)缺陷或失調(diào)與腫瘤、衰老以及免疫缺陷等密切相關(guān)。非同源末端連接（Non-homolouous end joining，NHEJ）和同源重組（Homologous recombination，HR）是DSB修復(fù)的兩條主要通路。 一般地，HR被認(rèn)為是DNA高保真的修復(fù)方式，但在特定情況下，如對于富含重復(fù)序列的異染色質(zhì)來說，HR修復(fù)則容易造成非等位基因間同源重組（non-allelic homologous recombination，NAHR），從而導(dǎo)致染色體的重排與畸變。因此，細(xì)胞如何調(diào)控和選擇這兩種途徑對DNA修復(fù)的精確性以及基因組穩(wěn)定性的維持至關(guān)重要。

DNA雙鏈斷裂末端的加工模式?jīng)Q定了NHEJ/HR修復(fù)途徑的選擇。此外，不同的染色質(zhì)狀態(tài)以及核內(nèi)空間分布也影響著DSB修復(fù)，比如異染色質(zhì)核纖層關(guān)聯(lián)域（Lamina-associated domains，LADs）分布在核周（nuclear periphery），更傾向于原位的NHEJ修復(fù)。但是，如何根據(jù)不同的染色質(zhì)狀態(tài)以及核內(nèi)空間分布實現(xiàn)不同的DSB末端加工和修復(fù)途徑的選擇，目前研究仍然知之甚少。

PARP抑制劑 （PARPi） 是臨床上治療BRCA突變?nèi)橄侔┖吐殉舶┑囊痪€靶向藥物，可以通過合成致死的方式特異性殺死BRCA突變的腫瘤細(xì)胞。但是，如果腫瘤細(xì)胞中NHEJ的某些關(guān)鍵調(diào)控因子如53BP1、RIF1等發(fā)生缺失或突變，則會導(dǎo)致HR通路重新激活，從而引起對PARPi的抗藥性。利用這個特性，可以通過全基因組水平的PARPi耐藥篩選，尋找一些能調(diào)控NHEJ/HR修復(fù)通路選擇且未知的NHEJ調(diào)控因子 。

該研究利用CRISPR篩選，報道了核膜錨定的核酸酶NUMEN/ENDOD1參與NHEJ修復(fù)通路，并通過特異性切割3'垂懸DNA （3' overhang DNA） 調(diào)控NHEJ/HR通路的選擇。

NUMEN的核膜定位為核周分布的LADs進(jìn)行NHEJ修復(fù)創(chuàng)造了條件，有利于基因組穩(wěn)定性的維持。 另外，NUMEN的缺失也會導(dǎo)致BRCA1突變的腫瘤細(xì)胞對PARPi產(chǎn)生耐藥。

NUMEN的發(fā)現(xiàn)解釋了細(xì)胞如何根據(jù)不同染色質(zhì)狀態(tài)以及核內(nèi)空間分布選擇有利的DSB修復(fù)方式，以大程度維持基因組的穩(wěn)定性。 研究團(tuán)隊首先通過全基因組的CRISPR敲除篩選，得到一系列可造成PARPi耐藥的候選基因，其中包括已知的耐藥基因如53BP1、RNF168與SLFN11等，證明了篩選結(jié)果的可靠性。

其中，ENDOD1作為一個潛在的核酸酶，在篩選結(jié)果中排名靠前且在DNA損傷修復(fù)中的作用幾乎未見報道，于是研究人員重點選取了ENDOD1作為實驗研究的對象。

基于本研究中發(fā)現(xiàn)ENDOD1的一些新特征，研究團(tuán)隊將其重新命名為 NUMEN （Nuclear membrane endo/exonuclease） 。 研究團(tuán)隊接下來驗證了NUMEN敲除可導(dǎo)致多種BRCA1突變的腫瘤細(xì)胞對PARPi耐藥，其缺失也可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對多種DNA損傷藥物更為敏感。

接下來，研究人員通過體外酶切實驗鑒定了NUMEN蛋白的酶活特性，發(fā)現(xiàn)NUMEN同時具有核酸內(nèi)切酶和3'→5'外切酶活性， 能特異切割ssDNA以及3' overhang DNA，產(chǎn)生1-4 nt 5' overhang末端 。 有趣的是，在相同的反應(yīng)濃度下，NUMEN沒有顯示出對雙鏈DNA內(nèi)部和RNA底物有的切割活性。 NUMEN切割雙鏈DNA末端產(chǎn)生的1-4 nt 5' overhang已被證實比3' overhang DSB具有更高的NHEJ效率，研究人員推測NUMEN參與細(xì)胞內(nèi)NHEJ修復(fù)的過程。

進(jìn)一步，研究團(tuán)隊確認(rèn)NUMEN敲除可以使細(xì)胞核內(nèi)3' overhang DNA累積增加，HR總體水平升高，NHEJ通路受到破壞； 過表達(dá)NUMEN則有相反的效果。 對于TRF2敲除的細(xì)胞，NUMEN失活導(dǎo)致NHEJ依賴的端粒融合比例下降。 另外，NUMEN缺失也可以重新激活BRCA1敲除細(xì)胞的HR修復(fù)通路，這是BRCA1突變細(xì)胞產(chǎn)生PARPi耐藥的基礎(chǔ)。 通過以上實驗，研究人員證實了 NUMEN可以促進(jìn)NHEJ并抑制HR修復(fù)，通過拮抗3' overhang形成參與調(diào)控DNA雙鏈損傷修復(fù)途徑的選擇 。

免疫熒光結(jié)果顯示，NUMEN定位于細(xì)胞核膜 。 利用鄰近蛋白標(biāo)記技術(shù)（BioID），研究人員進(jìn)一步鑒定了NUMEN的相互作用蛋白組。 除了與NHEJ通路的關(guān)鍵蛋白DNA-PKcs相互作用外，大量的核膜蛋白包括LAD相關(guān)蛋白也在質(zhì)譜中富集。 運用超分辨顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞追蹤發(fā)現(xiàn)，一部分細(xì)胞核內(nèi)部的DSB損傷點可以動態(tài)地移到核膜與NUMEN發(fā)生互作； 而核周區(qū)域產(chǎn)生的DSB也能在核膜附近進(jìn)行原位修復(fù)。 那么，作為一個核酸酶，NUMEN錨定在核膜的意義是什么呢？ 結(jié)合LADs更傾向于在原位進(jìn)行NHEJ修復(fù)，研究人員猜測NUMEN與LADs的損傷修復(fù)相關(guān)。

為此，研究團(tuán)隊構(gòu)建了用于追蹤LADs的m6A-Tracer系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn) NUMEN與LADs存在很好的共定位 。 利用zeocin誘導(dǎo)DSB形成，研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)NHEJ標(biāo)志蛋白53BP1和RIF1在核周與NUMEN的共定位比HR標(biāo)志蛋白更多，而NUMEN敲除后53BP1的核周分布則明顯減少。 利用CRISPR/Cas9對分布在LADs上的LINE重復(fù)序列進(jìn)行切割，研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn) NUMEN敲除導(dǎo)致LADs上的DSB修復(fù)效率變慢 。

研究團(tuán)隊通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，NUMEN低表達(dá)的乳腺癌樣本中，與基因組瘢痕（Genomic Scar）相關(guān)的幾種特征都有所升高； 而且NUMEN表達(dá)水平與多種腫瘤的基因組拷貝數(shù)變異（CNV）呈負(fù)相關(guān)。 這提示NUMEN對基因組穩(wěn)定性的維持起著重要的作用 。

另外，研究團(tuán)隊還發(fā)現(xiàn)，NUMEN與BRCA1的表達(dá)水平也有著微妙的平衡關(guān)系，研究團(tuán)隊猜測NUMEN可能通過避免高重復(fù)序列的異染色質(zhì)間發(fā)生NAHR繼而對基因組起保護(hù)作用。

綜上所述，該研究揭示了 NUMEN作為一個新發(fā)現(xiàn)的核膜錨定核酸酶，可以對DSB末端和3' overhang DNA進(jìn)行切割，產(chǎn)生有利于NHEJ修復(fù)的底物，并調(diào)控NHEJ/HR通路的選擇。NUMEN的核膜定位促進(jìn)了LADs進(jìn)行NHEJ修復(fù)，有助于基因組穩(wěn)定性的維持。