LncRNA維持多能干細(xì)胞基因組穩(wěn)態(tài)新機(jī)制

多能干細(xì)胞 （Pluripotent stem cells，PSCs） 因在體外具無(wú)限增殖和分化為不同類型細(xì)胞的潛能，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中頗具應(yīng)用前景，也成為目前臨床上具潛能的成藥細(xì)胞。PSCs制備過(guò)程中的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)模化及細(xì)胞質(zhì)量穩(wěn)定性是走向臨床應(yīng)用的先決條件，但人PSCs在體外擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)程中，易出現(xiàn)遺傳和表觀遺傳的變異，嚴(yán)重阻礙了PSCs的臨床應(yīng)用。因此，研究PSCs遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性維持機(jī)理，是尋找改善策略、突破應(yīng)用瓶頸的關(guān)鍵。

PSCs基因組的突變率遠(yuǎn)低于分化細(xì)胞。中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所鄭萍團(tuán)隊(duì)與合作者的前期研究表明，PSCs利用不同于體細(xì)胞的特殊機(jī)制，有效調(diào)控基因組穩(wěn)定。鄭萍團(tuán)隊(duì)前期已鑒定了PSCs在DNA復(fù)制、DNA損傷修復(fù)中的一些特殊分子及作用機(jī)制。

該研究鑒定了在小鼠胚胎干細(xì)胞 （mESCs） 中特異表達(dá)的全新長(zhǎng)非編碼RNA-LncRNA NONMMUT028956 （簡(jiǎn)寫為Lnc956） 。 對(duì)該LncRNA的系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，它不僅參與復(fù)制壓力下mESCs復(fù)制小體穩(wěn)定的維持，而且還監(jiān)控mESCs基因組的質(zhì)量，從而確保mESCs基因組穩(wěn)態(tài)

長(zhǎng)非編碼RNA （lncRNA） 在多種生物學(xué)功能中起重要作用。由于技術(shù)手段的限制，目前尚未有發(fā)現(xiàn)復(fù)制叉上具功能性長(zhǎng)非編碼RNA的報(bào)道。研究團(tuán)隊(duì)利用前期研發(fā)的分離新生DNA鏈上 （即復(fù)制叉） RNA技術(shù) （isolate RNAs on nascent DNA，iROND） ，鑒定了ESCs復(fù)制叉上特異的新的功能性LncRNA-Lnc956。

對(duì)該LncRNA的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)復(fù)制壓力發(fā)生時(shí)，Lnc956能有效聚集到復(fù)制叉上，并大量招募Trim28和Hsp90b1聚集于復(fù)制叉形成復(fù)合體。Trim28直接與DNA復(fù)制解旋酶復(fù)合體MCM2-7相互作用，拉近了Lnc956-Trim28-Hsp90b1復(fù)合體與MCM2-7復(fù)合體之間的物理距離，使分子伴侶Hsp90b1通過(guò)GTP水解活性作用于MCM7，阻礙MCM7進(jìn)行K48和K63泛素化 （MCM7泛素化會(huì)導(dǎo)致復(fù)制小體解離） ，從而使復(fù)制小體能在一定程度復(fù)制壓力情況下得以穩(wěn)定，保持了基因組的完整性。

研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)Lnc956缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎部分致死。致死原因主要是胚胎細(xì)胞大量擴(kuò)增過(guò)程中，細(xì)胞出現(xiàn)明顯基因組不穩(wěn)定現(xiàn)象，并導(dǎo)致胞質(zhì)DNA水平增加，引起較嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)?？傊?，該研究成果迄今發(fā)現(xiàn)了小鼠多能干細(xì)胞復(fù)制叉上特異性功能性長(zhǎng)非編碼RNA-Lnc956，并揭示了Lnc956維持多能干細(xì)胞基因組穩(wěn)定和促進(jìn)胚胎發(fā)育的分子機(jī)制。 

有效清除基因組損傷的細(xì)胞個(gè)體，是干細(xì)胞維持群體基因組穩(wěn)定的重要方式。 p53 是目前已知的干細(xì)胞基因組質(zhì)量監(jiān)控分子。p53通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平上抑制多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因的表達(dá)，激活分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)基因的轉(zhuǎn)錄，使PSCs快速啟動(dòng)分化和凋亡，確保PSCs的基因組質(zhì)量。除了p53通路，是否還存在其他獨(dú)立的機(jī)制調(diào)控?fù)p傷干細(xì)胞的清除，值得進(jìn)一步研究。 

研究團(tuán)隊(duì)針對(duì)新鑒定的LncRNA- Lnc956 在干細(xì)胞質(zhì)量控制中發(fā)揮的作用做了深入探索。利用多種DNA損傷藥物處理、分化、凋亡、單克隆形成、克隆競(jìng)爭(zhēng)性和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法對(duì)該LncRNA功能研究后，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)缺失 Lnc956 的ESCs在受到DNA損傷后不易啟動(dòng)分化和凋亡，提示 Lnc956 參與DNA損傷后ESCs的分化和凋亡。但是， Lnc956 缺失的ESC中，p53通路的激活和功能未受影響，提示p53沒(méi)有介導(dǎo)Lnc956的調(diào)控作用。

為探究 Lnc956 分子水平上具體作用機(jī)理，研究團(tuán)隊(duì)利用In vitro/in vivo RNA pull down、蛋白質(zhì)質(zhì)譜及RNA免疫共沉淀等技術(shù)鑒定出與 Lnc956 相互作用的靶蛋白-KLF4。通過(guò)機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)，在未受DNA損傷時(shí)， Lnc956 與KLF4無(wú)相互作用。而在基因組受損后，DNA損傷反應(yīng)通路的核心激酶ATM激活，ATM活化Mettl3 （調(diào)控RNA m6A修飾） ，使Lnc956發(fā)生m6A修飾。發(fā)生m6A修飾的Lnc956大量結(jié)合干性維持關(guān)鍵蛋白KLF4。Lnc956-KLF4結(jié)合體滯留KLF4蛋白，阻止KLF4蛋白對(duì)ESCs多能性的調(diào)控，阻止KLF4蛋白結(jié)合到DNA上行使干性調(diào)控功能，使基因組損傷的干細(xì)胞快速發(fā)生分化，得以清除。

Lnc956-KLF4通路不依賴p53，和p53通路平行，共同對(duì)干細(xì)胞基因組質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。因此，當(dāng)ESCs受到DNA損傷應(yīng)激時(shí)，磷酸化的ATM信號(hào)通路可分別激活p53和Lnc956-KLF4兩條通路，使未受DNA損傷修復(fù)的ESCs快速發(fā)生分化和凋亡，高效清除受損ESCs，防止受損ESCs傳遞到子代，確保了ESCs遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性和安全性。