乳雙歧桿菌Probio-M8通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者的骨代謝

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的衰老相關(guān)疾病，其特征是骨流失和骨組織結(jié)構(gòu)退化，它影響著全球超過2億人，每年造成890萬(wàn)例骨折。此外，有超過30%的50歲以上婦女絕經(jīng)后都患有骨質(zhì)疏松癥。許多因素會(huì)導(dǎo)致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMO)的發(fā)生和發(fā)展，如遺傳易感性、生活方式和飲食，絕經(jīng)和衰老相關(guān)的雌激素的缺失起著決定性的作用。骨組織通過骨吸收和骨形成的協(xié)同作用不斷重塑，骨代謝的動(dòng)力學(xué)由雌激素、PTH和VD共同調(diào)節(jié)。絕經(jīng)后婦女的雌激素水平下降、PTH增加和腎臟內(nèi)維生素D激活的減少可能導(dǎo)致循環(huán)和靶組織中的骨化三醇缺失，從而影響腸道對(duì)鈣和磷酸鹽的吸收，導(dǎo)致礦化穩(wěn)態(tài)和骨吸收的失調(diào)。目前骨化三醇已被引入歐洲市場(chǎng)，特別是用于PMO和腎骨病。然而，PMO的治療是一個(gè)長(zhǎng)期的過程，長(zhǎng)期服用藥物可能會(huì)導(dǎo)致副作用，如便秘和高鈣血癥。因此，探索新的治療途徑以緩解現(xiàn)有方案的副作用是很有意義的。 腸道微生物群及其代謝物與人體健康密切相關(guān)，包括骨代謝。研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥老年患者的骨密度(BMD)降低很可能與腸道生態(tài)失調(diào)有關(guān)，提示腸道微生物群可能是治療PMO的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。益生菌的使用已被證明對(duì)骨代謝有良好的影響，但益生菌調(diào)節(jié)腸道微生物組/代謝組在改善骨代謝中的作用尚未得到闡明。乳雙歧桿菌Probio-M8是從一名健康女性的母乳中分離出的一種新型益生菌。在先前的研究中，Probio-M8可以通過增加促進(jìn)健康的腸道微生物的豐度來緩解神經(jīng)退行性疾病和哮喘。因此，本研究作為一項(xiàng)初步研究，旨在探討Probio-M8配合常規(guī)治療(鈣和骨化三醇)改善PMO患者骨代謝的作用和機(jī)制。

結(jié)果

1.聯(lián)合給藥Probio-M8可改善骨代謝和成骨細(xì)胞活性

在基線時(shí)，Probio-M8組和安慰劑組之間的所有監(jiān)測(cè)參數(shù)都沒有明顯的差異；而在干預(yù)結(jié)束時(shí)，兩組間血清中PCT、PTH、VD3和鈣的濃度均有差異(表1)。在第3個(gè)月時(shí)，Probio-M8組(0.03 ± 0.01 ng/mL)較安慰劑組(0.04±0.01 ng/mL)PCT水平降低(P<0.01)；PTH水平(Probio-M8組：36.49±18.24 pg/L，安慰劑組：45.05±19.39 pg/L；P=0.039)和鈣水平(Probio-M8組：2.27±0.12 mmol/L，安慰劑組：2.38±0.12 mmol/L；P=0.013)低于安慰劑組，而VD3水平則相反(Probio-M8組：26.22±7.90 ng/L，安慰劑組：20.52±7.07 ng/L；P=0.032)?？v向比較顯示，兩組在第3個(gè)月時(shí)ALP水平均下降，Probio-M8組中觀察到OC降低。這些結(jié)果共同表明，Probio-M8與鈣和骨化三醇聯(lián)合給藥比僅服用鈣和骨化三醇更有利于骨代謝的改善。

2.聯(lián)合給藥Probio-M8并沒有改變受試者的腸道微生物群多樣性

在受試者腸道微生物群的α多樣性中，未觀察到明顯的組內(nèi)或組間差異(圖2a)。同樣，PCoA(Bray-Curtis距離)評(píng)分圖也沒有顯示任何基于組內(nèi)或組間的聚類(圖2b)。結(jié)果表明，益生菌攝入沒有引起受試者腸道微生物群多樣性和結(jié)構(gòu)的明顯變化。

a Probio-M8組和安慰劑組分別在基線(0 M)和3個(gè)月干預(yù)(3 M)后的糞便微生物群的Shannon多樣性指數(shù)。b 兩組在不同時(shí)間點(diǎn)的主坐標(biāo)分析(PCoA)評(píng)分圖。c 兩組在不同時(shí)間點(diǎn)反應(yīng)性SGB的豐度比較。

3.聯(lián)合給藥Probio-M8增強(qiáng)了POM患者的腸道微生物群相互作用

我們構(gòu)建了屬水平的腸道微生物互作網(wǎng)絡(luò)(圖3)，相關(guān)強(qiáng)度定義為：非常強(qiáng)(|r|≥0.8)、強(qiáng)(0.6≤|r|<0.8)和中等(0.5≤|r|<0.6)。在基線時(shí)，總共檢測(cè)到31個(gè)相關(guān)性(8個(gè)強(qiáng)正相關(guān)，16個(gè)中度正相關(guān)，7個(gè)中度負(fù)相關(guān))。雖然兩組的微生物互作在第3月時(shí)與基線相比都有所增加，但第3月時(shí)Probio-M8組明顯更強(qiáng)，具有到76個(gè)相關(guān)性(1個(gè)非常強(qiáng)正相關(guān)，31個(gè)強(qiáng)正相關(guān)，15個(gè)中度正相關(guān)，12個(gè)強(qiáng)負(fù)相關(guān)，17個(gè)中度負(fù)相關(guān)；包括一些的產(chǎn)丁酸菌，如Ruminococcus、Butyricicoccus、Eubacterium)。相比之下，安慰劑組的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)性較低，只檢測(cè)到39個(gè)相關(guān)性(3個(gè)非常強(qiáng)正相關(guān)，18個(gè)強(qiáng)正相關(guān)，4個(gè)中度正相關(guān)，1個(gè)非常強(qiáng)負(fù)相關(guān)，12個(gè)強(qiáng)負(fù)相關(guān)，1個(gè)中度負(fù)相關(guān))。值得注意的是，Probio-M8組在第3個(gè)月時(shí)檢測(cè)到雙歧桿菌與Eubacterium、Blautia、Ruminococcus的正相關(guān)性進(jìn)一步增強(qiáng)，而在安慰劑組沒有。結(jié)果表明，Probio-M8聯(lián)合給藥增強(qiáng)了患者腸道微生物群互作的強(qiáng)度。

4.聯(lián)合給藥Probio-M8可調(diào)節(jié)腸道微生物群中編碼的骨代謝相關(guān)功能

利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)受試者腸道微生物群中編碼的通路和功能進(jìn)行了注釋(圖4)，共注釋了6095個(gè)富集通路(KOs)。我們鑒定出22個(gè)反應(yīng)性KOs，在基線時(shí)組間沒有明顯的差異，但在第3月時(shí)的豐度差異。有4個(gè)反應(yīng)性KOs在安慰劑組比Probio-M8組明顯更高(K00338、K03617、K18377、K03346，參與能量代謝和蛋白質(zhì)家族：遺傳信息處理)，而其余18個(gè)KOs在Probio-M8組中比安慰劑組更豐富(碳水化合物代謝[K00847、K02770、K02781、K03332；編碼果糖和甘露糖代謝的不同途徑]、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[K02389、K02397]、其他氨基酸的代謝[K00968]、膜轉(zhuǎn)運(yùn)[K02806、K18891]、蛋白質(zhì)家族：遺傳信息處理[K19339]、表征不佳的途徑[K02426、K06877、K06921、K07075、K07128、K09976]和未分類的途徑[K01447，K19336])。

討論

骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性骨病，它與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成之間的動(dòng)態(tài)平衡有關(guān)，通常使用常規(guī)藥物或鈣、骨化三醇等膳食補(bǔ)充劑來干預(yù)。腸道微生物群和骨質(zhì)疏松癥之間有很強(qiáng)的聯(lián)系?；谝嫔謴?fù)疾病相關(guān)的腸道微生物群失調(diào)的能力，我們探究了益生菌與常規(guī)藥物聯(lián)合干預(yù)在PMO患者骨代謝中的有益作用，發(fā)現(xiàn)Probio-M8與鈣和骨化三醇聯(lián)合使用3個(gè)月可以改善患者的骨代謝。

本研究結(jié)果顯示，Probio-M8可改善骨質(zhì)疏松患者的鈣和磷代謝，同時(shí)提高骨質(zhì)疏松患者的抗炎指標(biāo)。血液中鈣重要的兩個(gè)調(diào)節(jié)因子是PTH和VD3。高PTH濃度增加骨的鈣釋放，導(dǎo)致骨吸收。既往多項(xiàng)研究表明，口服鈣和多種益生菌可降低血液PTH水平，減輕骨吸收，這與我們的研究結(jié)果一致。我們還發(fā)現(xiàn)，在干預(yù)第3個(gè)月時(shí)，血清鈣濃度僅在安慰劑組升高，而Probio-M8組沒有，這可能是由于PTH的降低，這意味著骨礦物質(zhì)的保留增多和骨吸收的減少。VD通過維持骨鈣穩(wěn)態(tài)、維持骨密度和防止骨吸收，在整體健康中起著至關(guān)重要的作用。聯(lián)合給藥Probio-M8可改善受試者的總血清VD3水平，血清VD水平升高表明鈣吸收得到改善。

因此，Probio-M8組受試者血清中VD3的升高和鈣的降低可能表明了骨形成活性的增加。此外，干預(yù)后Probio-M8組與安慰劑組中達(dá)到正常血清VD3水平(>30 ng/mL)的受試者比例為8：1，這表明益生菌可有效增加血清VD3和防止骨流失。血清PCT水平是全身炎癥和自身免疫性疾病的生物標(biāo)志物，攝入Probio-M8后PCT降低，表明Probio-M8可緩解骨質(zhì)疏松患者的全身炎癥。同時(shí)，PCT也是降鈣素的前體，主要由甲狀腺濾泡旁C細(xì)胞產(chǎn)生。一些研究一致發(fā)現(xiàn)，降鈣素在超過生理劑量下應(yīng)用可迅速抑制破骨細(xì)胞的功能。相比之下，PCT的生物學(xué)功能研究尚不一致。一些研究發(fā)現(xiàn)PCT與骨質(zhì)疏松癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，而其他研究發(fā)現(xiàn)PCT與OC呈負(fù)相關(guān)。因此，益生菌攝入后血清PCT下降的確切作用和機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。 聯(lián)合給藥Probio-M8降低了ALP和OC水平，它們是骨形成的生物標(biāo)志物，而ALP也被認(rèn)為是骨轉(zhuǎn)換的標(biāo)志物。

2014年，Britton等人在絕經(jīng)期去卵巢小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，攝入羅伊氏乳桿菌可降低骨特異性ALP水平，表明益生菌干預(yù)使骨轉(zhuǎn)換減少和骨流失減少，與本研究一致。我們的研究觀察到Probio-M8組的血清OC水平在第3個(gè)月時(shí)降低，而安慰劑組則沒有，這與用長(zhǎng)雙歧桿菌干預(yù)16周后卵巢切除大鼠血清OC水平升高的結(jié)果形成對(duì)比。在骨形成過程中，成骨細(xì)胞合成后OC可直接釋放到血液中；但在骨吸收過程中，它也可以通過破骨細(xì)胞的骨基質(zhì)降解進(jìn)入循環(huán)。另一方面，一項(xiàng)薈萃分析發(fā)現(xiàn)OC在葡萄糖代謝注入的血液循環(huán)中存在異質(zhì)性，指出血清OC可能不是骨形成的良好指標(biāo)，而是骨轉(zhuǎn)換的指標(biāo)。因此，與基線水平相比，Probio-M8組血清OC的下降似乎反映了在第3月時(shí)的骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)的降低。

人類腸道微生物群被描述為“骨質(zhì)疏松和成骨的關(guān)鍵介質(zhì)”，而骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)減少的女性的腸道微生物群也發(fā)生了改變。由于腸道微生物群可能在PMO的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮積極作用，它也可能作為管理PMO的治療靶點(diǎn)。益生菌可以調(diào)節(jié)腸道微生物群，改善各種疾病的臨床癥狀，如冠狀動(dòng)脈疾病、哮喘、胃腸道疾病。此外，之前的一些臨床研究報(bào)道了益生菌干預(yù)可以改善骨骼健康，但很少有研究致力于分析益生菌驅(qū)動(dòng)的腸道菌群反應(yīng)與癥狀改善之間的相關(guān)性。因此，本研究中我們重點(diǎn)分析了受試者攝入益生菌后腸道菌群的變化。在三個(gè)月的干預(yù)后，我們發(fā)現(xiàn)無論是Probio-M8組還是安慰劑組，受試者的α多樣性和腸道微生物群結(jié)構(gòu)均未觀察到變化。相比之下，Takimoto等人觀察到，健康絕經(jīng)后日本婦女使用Bacillus subtilis C-3102干預(yù)24周后，腸道微生物群的豐富度和多樣性均增加。

這種不一致性可能是由于不同研究之間的干預(yù)時(shí)間和益生菌菌株的不同所致。雖然通常認(rèn)為高度的多樣性表明了“健康的微生物群”，但這種觀點(diǎn)已受到了質(zhì)疑。我們的結(jié)果表明，攝入Probio-M8只伴隨著宿主腸道微生物群多樣性和結(jié)構(gòu)的適度變化。有趣的是，Probio-M8的腸道微生物互作網(wǎng)絡(luò)與安慰劑組的腸道微生物互作網(wǎng)絡(luò)不同。腸道微生物群與宿主健康密切相關(guān)，腸道微生物的互作網(wǎng)絡(luò)反映了與腸道微生物群動(dòng)態(tài)變化相關(guān)的健康狀況改善和/或癥狀緩解。研究表明，攝入益生菌可以加強(qiáng)原生菌群的互作，抑制潛在的腸道病原體。這種方法也被用于確定飲食引起的人類腸道微生物群變化與代謝健康之間的聯(lián)系。我們發(fā)現(xiàn)，在第3個(gè)月時(shí)，Probio-M8組的腸道微生物群相互相關(guān)網(wǎng)絡(luò)增強(qiáng)。特別是普遍認(rèn)為的有益菌，與一些主要產(chǎn)生的短鏈脂肪酸的類群的相關(guān)性，如雙歧桿菌和Eubacterium、Blautia、Ruminococcus呈正相關(guān)；據(jù)報(bào)道，Ruminococcus與骨質(zhì)疏松癥的存在呈負(fù)相關(guān)。

因此，我們可以合理地推測(cè)，Probio-M8的攝入增強(qiáng)了腸道生態(tài)位中特定有益菌之間的聯(lián)系，促進(jìn)了PMO患者的健康。但值得注意的是，腸道微生物群互作分析本身并不能提供因果關(guān)系的可靠證據(jù)，這需要進(jìn)一步驗(yàn)證。 腸道微生物群的調(diào)節(jié)通常會(huì)影響腸道宏基因組的功能。因此，我們分析了益生菌干預(yù)后宏基因組功能特征的變化。在Probio-M8組中，編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、果糖和甘露糖代謝途徑的基因均有增加。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體經(jīng)常與糖苷水解酶編碼基因共定位和共調(diào)控。磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)是微生物物種中高親和力碳水化合物攝取的常見機(jī)制。這些基因的增加提示了碳水化合物攝取和利用的增強(qiáng)。

此前有研究表明，給大鼠喂食果糖可誘導(dǎo)胰島素抵抗，加速骨質(zhì)疏松癥，提示果糖攝入可能會(huì)加重骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制。我們觀察到，在Probio-M8攝入后，果糖和甘露糖代謝途徑的編碼基因豐度增加，這表明益生菌聯(lián)合給藥可以加速患者腸道中果糖的利用，減輕PMO癥狀。 此外，Probio-M8處理后，膽堿磷酸胞苷基轉(zhuǎn)移酶(K00968)的基因豐度增加。膽堿磷酸胞苷基轉(zhuǎn)移酶是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中磷脂酰膽堿生物合成的主要速率決定酶。中國(guó)受試者的血清磷脂酰膽堿水平已被證明與BMD相關(guān)，但相關(guān)方向取決于它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)和脂肪酸組合。例如，兩種磷脂酰膽堿(分別為16:0/18:3