METTL3介導(dǎo)的m6A修飾可抑制成骨細(xì)胞衰老

老年骨質(zhì)疏松癥主要由成骨細(xì)胞功能衰減引起，進(jìn)而導(dǎo)致骨量減少和骨重塑過程破壞。目前許多研究表明m6A修飾在骨質(zhì)疏松癥的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，但大多數(shù)研究集中在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化的作用上，而m6A對成骨細(xì)胞的直接調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科夏亞一教授和耿彬教授合作，在老年骨質(zhì)疏松癥患者中揭示了m6A修飾和甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（METTL3）表達(dá)降低。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)表明，METTL3抑制了成骨細(xì)胞衰老，而成骨細(xì)胞功能障礙會(huì)影響骨代謝平衡。隨后MeRIP-seq和mRNA-seq聯(lián)合揭示了METTL3調(diào)控Hspa1a轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性。在METTL3抑制成骨細(xì)胞衰老過程中，YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白2（YTHDF2）延緩了Hspa1a mRNA的衰減。METTL3在小鼠成骨細(xì)胞中特異性過表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)METTL3可以抑制老年骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展。

研究摘要：

本研究揭示了老年骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展與m6A修飾和METTL3下調(diào)密切相關(guān)。METTL3過表達(dá)可以抑制成骨細(xì)胞的衰老。甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）揭示了METTL3通過上調(diào)Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性來抑制成骨細(xì)胞衰老。此外，結(jié)果表明METTL3通過m6A修飾增強(qiáng)Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性來調(diào)控成骨細(xì)胞衰老。YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白2（YTHDF2）參與METTL3介導(dǎo)的m6A修飾過程中Hspa1a mRNA的穩(wěn)定。從機(jī)制上講，METTL3以YTHDF2依賴性方式增加Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性，以抑制成骨細(xì)胞衰老。本研究結(jié)果證實(shí)了METTL3在成骨細(xì)胞衰老中的重要作用，并表明METTL3可能是老年骨質(zhì)疏松癥的潛在治療靶點(diǎn)。

結(jié)果圖形：

（1）老年骨質(zhì)疏松癥中m6A修飾減少

為了研究與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失與 m6A 修飾之間的關(guān)系，進(jìn)行比色法檢測骨組織中的m6A水平。檢測結(jié)果在老年骨質(zhì)疏松癥患者的骨組織中觀察到m6A修飾水平降低。由于m6A修飾主要受甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶調(diào)控，因此在骨組織中檢測METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1的mRNA水平。

·             老年骨質(zhì)疏松癥患者的骨樣本進(jìn)行了m6A水平的比色評(píng)估。（n=10）

·             老年骨質(zhì)疏松癥患者樣本進(jìn)行METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1表達(dá)的qRT-PCR分析。（n=10）

·             小鼠骨質(zhì)疏松癥骨組織進(jìn)行m6A水平的比色評(píng)估。（n=6）

·             western blot分析樣本中的METTL3蛋白水平。（n=6）

·             H2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞衰老過程中m6A水平的比色分析（n=3）。

·             通過β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細(xì)胞（n=3）。

·             透射電子顯微鏡分析線粒體形態(tài)（n=3）。

·             western blot分析樣本中METTL3蛋白水平（n=3）。

（2）METTL3 抑制體外成骨細(xì)胞衰老

在衰老過程中，骨微環(huán)境中的各種細(xì)胞類型都會(huì)經(jīng)歷衰老，導(dǎo)致骨形成減少和骨的負(fù)平衡。為了研究成骨細(xì)胞衰老是否歸因于m6A修飾減少和METTL3表達(dá)降低，建立了MC3T3-E1-shMETTL3，并從C57/BL6小鼠的原代成骨細(xì)胞中敲低了METTL3。

·             對METTL3基因敲除后的MC3T3-E1細(xì)胞和原代成骨細(xì)胞進(jìn)行m6A水平的比色評(píng)估（n=3）。

·             β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細(xì)胞（n=3）。

·             使用免疫熒光鑒定METTL3和p21的定位和表達(dá)，bar = 20 μm（n = 3）。

·             JC-1染色分析線粒體膜電位，bar =10μm（n = 3）。

·             Western Blot檢測METTL3、p53、CDK4和p21蛋白水平（n = 3）。

（3）成骨細(xì)胞功能對體外骨微環(huán)境代謝的影響

·             免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析METTL3和p21的表達(dá)，bar = 20 μm（n = 3）。

·             β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細(xì)胞（n=3）。

·             使用JC-1染色來評(píng)估線粒體膜電位，bar =10μm（n = 3）。

·             β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細(xì)胞（n = 3）。

·             EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞增殖，bar =50μm（n = 3）。

（4）MeRIP-seq揭示METTL3調(diào)控Hspa1a穩(wěn)定性

為研究METTL3在調(diào)控成骨細(xì)胞衰老中的潛在分子機(jī)制，研究人員在MC3T3-E1細(xì)胞中激活METTL3后，進(jìn)行了MeRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀測序）和mRNA-seq（mRNA測序）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在MC3T3-E1細(xì)胞中鑒定的m6A位點(diǎn)在 “GGAC”序列中富集，大部分m6A位點(diǎn)位于編碼序列（CDS）和3'非翻譯區(qū)（3'UTR）。me[x]tagene分析顯示m6A位點(diǎn)主要位于終止密碼子附近。MeRIP-seq和mRNA-seq分析鑒定出13個(gè)基因。驗(yàn)證了7個(gè)上調(diào)的潛在靶標(biāo)，qRT-PCR結(jié)果顯示Nr4a3和Hspa1a上調(diào)更為。在Hspa1a終止密碼子附近發(fā)現(xiàn)m6A峰的高豐度和特異性，表明Hspa1a可能是成骨細(xì)胞衰老的關(guān)鍵調(diào)控因子。通過SRAMP數(shù)據(jù)庫預(yù)測揭示Hspa1a mRNA中的多個(gè)高度可靠的m6A修飾位點(diǎn)。在METTL3沉默的MC3T3-E1細(xì)胞系和原代成骨細(xì)胞中，Hspa1a蛋白表達(dá)水平下調(diào)。免疫熒光結(jié)果也表明在METTL3沉默后Hspa1a表達(dá)下調(diào)。RIP-qPCR結(jié)果證實(shí)Hspa1a mRNA能直接與METTL3蛋白結(jié)合。MeRIP-qPCR驗(yàn)證了在METTL3沉默的細(xì)胞系中Hspa1a mRNA的m6A修飾水平降低。隨后進(jìn)行RNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以分析METTL3介導(dǎo)的m6A修飾對Hspa1a表達(dá)調(diào)控作用機(jī)制。METTL3沉默后，Hspa1a mRNA的衰減速快于對照組。這些結(jié)果表明METTL3增加了Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性并減少了其衰減。通過以上實(shí)驗(yàn)，研究人員揭示了METTL3通過m6A修飾正向調(diào)控Hspa1a mRNA穩(wěn)定性的機(jī)制，并揭示METTL3可能通過這一機(jī)制抑制成骨細(xì)胞衰老。

·             MeRIP-Seq分析顯示，成骨細(xì)胞“GGAC”motif在m6A位點(diǎn)富集。

·             對7個(gè)上調(diào)的潛在靶標(biāo)進(jìn)行qRT-PCR分析（n=3）。

·  Hspa1a終止密碼子附近的m6A峰具有高豐度和特異性。

·  Western Blot分析METTL3沉默后Hspa1a蛋白水平（n=3）。

· 免疫熒光檢測Hspa1a表達(dá)，bar=20μm（n=3）。

· RIP-qPCR研究Hspa1a mRNA-METTL3蛋白的直接互作（n=3）。

·             MeRIP-qPCR分析Hspa1a m6A修飾（n=3）

·             qRT-PCR檢測放線菌素D誘導(dǎo)后的mRNA水平以分析降解情況（n=3）。

（5）METTL3介導(dǎo)的m6A修飾以YTHDF2依賴性方式調(diào)控Hspa1a mRNA衰變

·             JC-1染色檢測線粒體膜電位，bar=10μm（n=3）。

·             β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細(xì)胞（n=3）。

·             免疫熒光檢測Hspa1a和p21表達(dá)，bar=20μm（n=3）。

·             Western Blot檢測METTL3、Hspa1a、YTHDF2和IGF2BP1蛋白水平（n=3）。

·             RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)鑒定與Hspa1a mRNA互作的m6A依賴性蛋白（n=3）。

（6）靶向成骨細(xì)胞中的METTL3可抑制老年性骨質(zhì)疏松癥進(jìn)展