結(jié)直腸癌的腸道菌群特征和病原真菌

腸道菌群是人體腸道微生物群的重要組成部分，但其在結(jié)直腸癌(CRC)中的作用仍不明確。我們進(jìn)行了一項(xiàng)薈萃分析，以揭示真菌菌群對(duì)CRC的貢獻(xiàn)。   

方法：

并建立了一個(gè)額外的內(nèi)部隊(duì)列，共計(jì)1329個(gè)宏基因組(454個(gè)CRC、350個(gè)腺瘤和525個(gè)健康受試者)。分析了真菌菌群組成和微生物相互作用。候選CRC富集真菌物種(Aspergillus rambellii)在體外和體內(nèi)進(jìn)行了功能驗(yàn)證。   

結(jié)果：

多隊(duì)列分析顯示CRC患者腸道菌群發(fā)生了改變。我們從多個(gè)隊(duì)列中確定了與CRC和腺瘤患者相關(guān)的真菌。標(biāo)志性CRC相關(guān)真菌包括6種富集真菌(Aspergillus rambellii、Cordyceps sp. RAO-2017、Erysiphe pulchra、Moniliophthora perniciosa、Sphaerulina musiva和Phytophthora capsici)和1種減少物種(Aspergillus kawachii)。

與腺瘤和健康受試者相比，CRC富集真菌之間的共現(xiàn)相互作用在CRC中變得更強(qiáng)。

此外，我們報(bào)道了CRC進(jìn)展過(guò)程中腸道真菌和細(xì)菌之間的跨界相互作用，其中A. rambellii與CRC富集細(xì)菌具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)密切相關(guān)。

A. rambellii促進(jìn)體外CRC細(xì)胞生長(zhǎng)和異種移植小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，真菌和細(xì)菌聯(lián)合生物標(biāo)志物比純細(xì)菌組更準(zhǔn)確地區(qū)分CRC患者和健康受試者(AUC相對(duì)變化增加1.44%-10.60%)。  

結(jié)論：

本研究揭示了結(jié)直腸腫瘤發(fā)生階段的腸道菌群特征和病原真菌。除細(xì)菌外，糞便真菌還可用于CRC患者的無(wú)創(chuàng)診斷。

結(jié)果

共有1329名受試者被納入CRC進(jìn)展的腸道菌群薈萃分析

在這項(xiàng)薈萃分析中，我們納入了8項(xiàng)已發(fā)表的研究，這些研究使用鳥(niǎo)槍法宏基因組學(xué)來(lái)表征CRC患者與健康受試者的糞便微生物群(表S1和S2)。

我們還建立了一個(gè)內(nèi)部糞便宏基因組數(shù)據(jù)作為額外的研究群體(表S1和S2)。在這些宏基因組中，中位數(shù)為0.16%(10-2.80)的總宏基因組reads被映射到真菌基因組，這與之前的研究一致(0.1%)。

稀疏曲線顯示，所有隊(duì)列樣本在真菌測(cè)序reads達(dá)到10,000時(shí)均達(dá)到平臺(tái)狀態(tài)。為了確保樣品質(zhì)量，我們采用了一系列嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)的過(guò)濾來(lái)去除污染或真菌含量低的樣品。

Hanningan等人的隊(duì)列進(jìn)行了PCR預(yù)處理，并且測(cè)序深度較低，因此該數(shù)據(jù)集被丟棄以避免后續(xù)分析中的擴(kuò)增偏差。

過(guò)濾后，共保留了1329個(gè)宏基因組，包括454名健康受試者(占檢索到的健康宏基因組總數(shù)的68%)、350名腺瘤患者(占檢索到的腺瘤宏基因組總數(shù)的73%)和525名CRC患者(占檢索到的CRC宏基因組總數(shù)的68%)。

CRC、腺瘤和健康受試者的丟棄樣本沒(méi)有差異，表明我們的樣本均勻分布在不同的研究對(duì)象組中。

丟棄樣本均勻分布在不同的研究對(duì)象組中(χ2 =4.03，p = 0.13；卡方檢驗(yàn))。 

腸道菌群在CRC進(jìn)展中發(fā)生改變 

首先研究了門(mén)水平的真菌組成。在所有隊(duì)列中，子囊菌門(mén)(Ascomycota)是CRC患者和健康受試者中普遍的真菌門(mén)。然后，我們比較了CRC患者和健康受試者之間前5個(gè)門(mén)的豐度，發(fā)現(xiàn)這些門(mén)在所有隊(duì)列中都沒(méi)有一致的豐度變化。

對(duì)于真菌豐富度，我們發(fā)現(xiàn)將所有隊(duì)列組合在一起時(shí)，CRC患者的α多樣性(chao1指數(shù))降低，這與之前的報(bào)告一致(p<0.05)。而僅在三個(gè)隊(duì)列中觀察到α多樣性的差異，表明存在隊(duì)列間變異。

使用主坐標(biāo)分析(PCoA)，我們發(fā)現(xiàn)各隊(duì)列間真菌群落的變化歸因于人群(洲或性別)和疾病階段(CRC、腺瘤或健康)的差異，與之前的研究一致。

體重指數(shù)(BMI)和腫瘤部位對(duì)真菌群落變化沒(méi)有影響。總體而言，我們證實(shí)了腸道真菌菌群與CRC的關(guān)聯(lián)。

確定CRC和腺瘤中的標(biāo)志性真菌種類 

為了表征CRC相關(guān)真菌，將所有CRC患者中相對(duì)豐度>0.1%(n=296)的單個(gè)真菌豐度與健康受試者進(jìn)行了比較。在FDR<0.1時(shí)，我們確定了74種真菌物種，其豐度存在差異，然后在FDR<0.01時(shí)，我們將其縮減為入圍的33種(下文稱為真菌核心組)(Wilcoxon秩和檢驗(yàn))。

該核心組由與CRC相關(guān)的具有不同豐度的物種組成，其中Aspergillus rambellii是豐富的，而Aspergillus kawachii少。每個(gè)真菌物種的豐度變化在隊(duì)列間差異很大，因此表明存在隊(duì)列間差異。

我們進(jìn)一步評(píng)估了隊(duì)列異質(zhì)性和潛在混雜因素對(duì)單個(gè)真菌物種的影響。與我們的PCoA分析一致，隊(duì)列異質(zhì)性比其他因素(年齡、BMI和性別)的影響更大。

值得注意的是，與隊(duì)列異質(zhì)性和其他混雜因素相比，疾病階段(CRC、腺瘤或健康)與33個(gè)物種的真菌核心組豐度的變化更密切相關(guān)，表明疾病階段對(duì)物種組成的影響大于隊(duì)列間變異。 

真菌核心組包括10種CRC富集真菌和23種CRC減少真菌。與健康受試者相比，CRC患者的A. rambelli豐度增加3.0倍，A. kawachii豐度減少2.0倍(p<0.0001)。

與健康受試者相比，CRC患者中A. rambelli的中位豐度更高，并且這種增加在8個(gè)隊(duì)列中的7個(gè)隊(duì)列中持續(xù)。

為了確定在不同隊(duì)列中一致變化的真菌，我們識(shí)別了8個(gè)隊(duì)列中至少在7個(gè)隊(duì)列中發(fā)生變化的18種真菌(7種CRC富集，11種CRC減少)。此外，在真菌核心組中，從CRC前體、早期CRC到晚期CRC，發(fā)現(xiàn)了2種真菌(Cordyceps sp. RAO-2017和Phytopythium vexans)且一致的富集，1種真菌(A. kawachii)減少，表明這些真菌物種在CRC進(jìn)展中的因果作用。 然后將CRC患者與腺瘤患者的真菌豐度進(jìn)行比較。

FDR<0.01時(shí)，在CRC和腺瘤患者之間發(fā)現(xiàn)了24種差異豐度真菌。

在這24種真菌中，觀察到1種CRC富集(A. rambellii)和6種CRC減少的真菌物種(A. kawachii、Fusarium pseudograminearum、Lentinula edodes、Hanseniaspora guilliermondii、Saitoella complicata和Cryptococcus neoformans)的豐度變化是腺瘤患者的1.4倍以上。

值得注意的是，當(dāng)將CRC患者與腺瘤患者和健康受試者進(jìn)行比較時(shí)，7種真菌的豐度發(fā)生了一致的改變，這表明它們是CRC腺瘤相關(guān)真菌的標(biāo)志性物種。這7種真菌包括6種CRC富集真菌

我們進(jìn)一步比較了腺瘤患者和健康受試者之間的真菌豐度。FDP<0.01時(shí)，在腺瘤患者和健康受試者之間發(fā)現(xiàn)了10種差異豐度真菌。

在這10種真菌中，腺瘤患者中5種真菌的豐度至少增加了1.5倍。

當(dāng)CRC患者與健康受試者比較時(shí)，這5種真菌未被納入核心組，表明這5種真菌僅與腺瘤相關(guān)，而與CRC無(wú)關(guān)。

總之，我們的多隊(duì)列宏基因組分析揭示了與CRC和腺瘤相關(guān)的標(biāo)志性真菌物種。

多隊(duì)列分析報(bào)告了一組與CRC密切相關(guān)的腸道真菌。

CRC患者與健康受試者的特征真菌種類比較

(A)真菌核心組包括10種CRC富集真菌和23種CRC減少真菌物種，其在CRC患者(n=454)、腺瘤患者(n=350)和健康受試者(n=525)之間的豐度存在差異。真菌豐度歸一化為相對(duì)于對(duì)照樣品豐度中值的自然對(duì)數(shù)倍數(shù)變化。臨床和隊(duì)列信息顯示在圖頂部，包括隊(duì)列、性別、年齡、腫瘤位置和BMI。

(B, C)所有隊(duì)列(B)和每個(gè)研究(C)中倍數(shù)變化大的兩種真菌A. rambellii(CRC富集)和A. kawachii(CRC減少)的小提琴圖。健康受試者和CRC患者分別用黃色和紅色表示。 

Aspergillus rambellii在體外和異種移植小鼠模型中促進(jìn)CRC

為了驗(yàn)證計(jì)算機(jī)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將兩種