革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)信號分子對宿主細胞的影響

 群體感應(yīng)(quorum sensing, QS)是原核生物中一種基于分子信號的通訊機制。在基本模式下，某些細菌釋放的信號分子被群落中其他成員的胞內(nèi)受體或膜結(jié)合受體感知，導(dǎo)致同源基因信號分子合成和同步活動。這種調(diào)節(jié)機制對于細菌與宿主的共生關(guān)系以及毒力和生物膜的形成至關(guān)重要。值得注意的是，群體感應(yīng)信號分子(QSSMs)不僅能夠控制微生物群落行為，還可以調(diào)節(jié)宿主細胞的生理狀態(tài)。本文對革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)信號分子在調(diào)節(jié)宿主細胞功能和腸道健康中的重要性進行了全面的綜述，并提出通過阻斷群體感應(yīng)信號分子發(fā)揮其功能的途徑來應(yīng)用于防治人類和動物疾病的可能性。  

綜述目錄

1 前言

2 革蘭氏陰性菌QSSM的特征

3 革蘭氏陰性菌QS系統(tǒng)

4 QSSM AHL對宿主細胞的影響及其潛在機制

5 QSSM AHL對宿主腸道健康的影響及其潛在機制

6 結(jié)論

主要內(nèi)容

1 前言

國際學(xué)術(shù)界將多種微生物共同生活的系統(tǒng)稱為微生物群落，也稱為微生物區(qū)系。然而，許多年前，研究人員發(fā)現(xiàn)細菌間可以相互通訊，通過這種通訊，它們獲得了協(xié)調(diào)運作的能力。細菌間通訊主要依賴于微生物群體感應(yīng)(QS)。QS的概念早由Fuqua等人提出，指只有當細菌數(shù)量達到一定密度時才會發(fā)生的感應(yīng)現(xiàn)象。據(jù)報道，在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中都存在QS，并且在細菌感染中經(jīng)常觀察到QS信號分子(QSSMs)的局部濃度升高。QS已成為微生物學(xué)領(lǐng)域的一個重要研究領(lǐng)域。20世紀60年代，Tomasz等人在肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)中發(fā)現(xiàn)了第一種QSSM。隨后的一項研究表明，QS系統(tǒng)廣泛存在于各種微生物種群中。隨著新的研究進展，研究者發(fā)現(xiàn)QSSM不僅可以調(diào)控微生物群體行為，還可以調(diào)節(jié)人類致病菌中毒力因子的表達，逐漸引起了公共衛(wèi)生領(lǐng)域的關(guān)注。

細菌群體感應(yīng)(QS)是細菌交換細胞內(nèi)或細胞間信息、協(xié)調(diào)種群行為、調(diào)節(jié)基因表達的機制，所有這些都取決于種群密度。當一個細菌群落達到一定密度時，它通過分泌可擴散的信號小分子(也稱為QSSMs)來啟動與細菌群落密度相關(guān)的基因表達。QSSMs擴散到環(huán)境中，當環(huán)境中的信號分子達到一定的閾值濃度時，它們會誘導(dǎo)細菌中依賴于細胞密度的特定基因的表達，從而導(dǎo)致細菌在群落規(guī)模上表現(xiàn)出新的行為特征，如生物發(fā)光、調(diào)節(jié)毒力因子分泌、芽胞形成或生物膜形成、細胞分化、運動和胞外多糖形成。目前已經(jīng)確定了多種微生物相關(guān)的QSSMs。對于革蘭氏陰性菌，大多數(shù)QSSMs屬于N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)家族。不同AHLs之間的主要區(qū)別在于N-側(cè)鏈的長度、3-碳位置的取代基以及側(cè)鏈中是否存在一個或多個不飽和鍵。

以往對QS的研究主要集中在微生物間的相互作用。近年來，QSSMs對宿主細胞功能的直接影響也引起了廣泛的關(guān)注。QSSMs是脂溶性小分子，很容易滲透到細胞內(nèi)影響細胞功能。本文綜述了國內(nèi)外有關(guān)微生物QS的研究現(xiàn)狀。基于對QS理解的新進展，我們還強調(diào)了QSSM AHL與宿主細胞之間相互作用的重要性，包括AHL在哺乳動物宿主細胞中的作用和潛在機制、AHL與腸道健康的關(guān)系以及AHL導(dǎo)致腸屏障功能障礙的機制。微生物QSSM的多靶點可能為細菌性感染性疾病的診斷和治療提供了新的可能性。

2 革蘭氏陰性菌QSSM的特征

i)小分子量：革蘭氏陰性菌QSSM，如AHL及其衍生物、寡肽、γ-丁內(nèi)酯等，都是可以自由進出細胞或由寡肽滲透酶分泌到環(huán)境中并在環(huán)境中積累的小分子。ii)物種特異性：AHL在革蘭氏陰性菌中具有強烈地特異性。通常，革蘭氏陰性菌使用LuxR型受體，這是一種細胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，可以檢測由伴侶LuxI型合酶產(chǎn)生的AHLs。iii)對生長期和細菌密度的依賴性：一般情況下，革蘭氏陰性菌QSSM在環(huán)境中的積累在細菌生長的對數(shù)期或穩(wěn)定期達到較高的濃度，此時它調(diào)節(jié)了大多數(shù)基因的表達。此外，細菌生長穩(wěn)定期的上清液可以在培養(yǎng)階段引起細菌生理狀態(tài)的變化(較低的細菌密度)。iv)在革蘭氏陰性菌感染中的調(diào)節(jié)作用：許多產(chǎn)生QSSM的革蘭氏陰性菌屬于動植物致病菌或共生細菌，其在細菌與宿主的相互作用中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

  3 革蘭氏陰性菌QS系統(tǒng)

革蘭氏陰性菌可向周圍環(huán)境釋放一類小分子信號因子(AHL)，該因子可自由進出細菌，AHL在QS系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用。表1顯示了不同革蘭氏陰性菌QSSMs及其功能的信息。

AHL早在海洋細菌費氏弧菌(Vibrio fischeri)的生物發(fā)光系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，這種現(xiàn)象與細菌的種群密度呈正相關(guān)。對于革蘭氏陰性菌，由LuxI/LuxR組成的QS系統(tǒng)研究廣泛。以費氏弧菌為例，該菌的LuxI同源基因負責(zé)QSSM AHL的合成，而LuxR同源基因作為AHL受體被激活，進而調(diào)控多種下游基因的轉(zhuǎn)錄。AHL介導(dǎo)的微生物間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可調(diào)控革蘭氏陰性菌的多種功能，如毒力因子的產(chǎn)生、抗生素和胞外多糖的生物合成、細胞聚集、進入穩(wěn)定生長期等。在細菌呈指數(shù)增長的過程中，AHL在細胞質(zhì)中合成并通過細胞膜擴散，從而到達細菌外部并在環(huán)境中積累。當AHL達到特定的臨界濃度時，LuxR與AHL結(jié)合形成LuxR-AHL復(fù)合體，該復(fù)合體可激活相關(guān)基因的啟動子，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄(圖1)。LuxR通過使用AHL作為折疊開關(guān)來穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，并在AHL缺失時自動降解。許多具有QS的細菌可以產(chǎn)生一種以上的AHL分子。例如，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)可以同時產(chǎn)生C4-HSL和3-oxo-C12-HSL，不同類型的AHL分子調(diào)節(jié)微生物群體行為的功能和機制可能存在差異。此外，一些研究人員發(fā)現(xiàn)，一些細菌缺乏與LuxI功能相似的基因，導(dǎo)致細菌無法自行合成AHL。有趣的是，這些細菌編碼LuxR的同源蛋白SdiA，該蛋白可以感知其他細菌產(chǎn)生的各種群體信號，并通過竊聽機制調(diào)節(jié)其自身QS相關(guān)基因的表達。

在以AHL為QSSM的革蘭氏陰性菌QS系統(tǒng)中，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑多樣。目前銅綠假單胞菌的研究為成熟，其主要包含四個QS系統(tǒng)。第一個是lasR/lasI系統(tǒng)，由轉(zhuǎn)錄激活因子lasR和乙酰高絲氨酸內(nèi)酯酶lasI蛋白組成。LasI指導(dǎo)QSSM N-3-氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯(3-oxoC12-HSL)的合成，并在主動運輸過程中將其分泌到細胞外。3-oxoC12-HSL能在一定閾值濃度下結(jié)合lasR，激活堿性蛋白酶、外毒素A、彈性酶等毒力因子的基因轉(zhuǎn)錄，從而增加銅綠假單胞菌毒力基因的表達。第二個是rhlR/rhlI系統(tǒng)。RhlR是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；RhlI編碼AHL合成酶。該系統(tǒng)產(chǎn)生高絲氨酸內(nèi)酯QSSM，其結(jié)構(gòu)為C4-HSL，可自由通過細胞膜，調(diào)節(jié)大量基因的表達，如幾丁質(zhì)酶、氰化物、綠膿素和其他基因。假單胞菌喹諾酮信號(PQS)是發(fā)現(xiàn)的銅綠假單胞菌的第三個QS系統(tǒng)。喹諾酮信號系統(tǒng)的信號分子具有抗菌活性且不溶于水，其利用細菌間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制尚不清楚。它可能涉及通過胞吐樣轉(zhuǎn)運機制在細菌之間傳遞PQS信號。PQS可以連接lasR/lasI和rhlR/rhlI兩個系統(tǒng)。一方面，lasR/lasI和rhlR/rhlI控制PQS的產(chǎn)生；另一方面，PQS影響lasR/lasI和rhlR/rhlI的基因表達。這兩者之間有著微妙的平衡。此外，PQS還發(fā)揮著調(diào)節(jié)細菌密度和釋放毒力因子的作用。除上述三種QS系統(tǒng)外，銅綠假單胞菌的另一種QS輔助系統(tǒng)GacS/GacA系統(tǒng)，被發(fā)現(xiàn)并報道其在提高細菌傳播能力、釋放可可堿乙酸鈉和促進生物膜形成方面發(fā)揮了重要作用。

4 QSSM AHL對宿主細胞的影響及其潛在機制 4.1 AHL對細胞凋亡的影響

QSSMs是一類脂溶性小分子，其可以通過擴散到達黏膜上皮或皮下組織，甚至擴散到脈管系統(tǒng)中。研究表明，AHL是革蘭氏陰性菌QSSM，可以影響宿主真核細胞的功能。由于其脂溶性，AHL可以迅速進入哺乳動物細胞，誘導(dǎo)細胞凋亡。因此，AHL在誘導(dǎo)宿主細胞凋亡中起著直接作用。AHLs可以快速啟動小鼠胚胎成纖維細胞的凋亡，激活caspase-3/7和8，使線粒體膜電位去極化，并將細胞色素c從線粒體釋放到細胞質(zhì)中，導(dǎo)致細胞和細胞核收縮，導(dǎo)致細胞死亡。將呼吸道上皮細胞暴露于AHLs僅1小時就會導(dǎo)致上皮細胞間的緊密連接解體。然而，有報道稱一種膜穿透性泛caspase抑制劑(Z-VAD-FMK)可以阻斷這種損傷，這表明緊密連接的破壞是由AHL引發(fā)的細胞凋亡的早期事件。低濃度的AHL足以降低未分化的Caco-2細胞的活力，并通過抑制AKT的磷酸化而誘導(dǎo)凋亡，而AKT過表達可部分逆轉(zhuǎn)細胞凋亡。此外，粘蛋白MUC3可保護上皮細胞免受AHL造成的損傷。AHL的促凋亡作用與細胞內(nèi)Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。用抑制Ca2+進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的抑制劑毒胡蘿卜素(thapsigargin)預(yù)處理細胞10分鐘可以保護屏障免受AHL損傷并減少細胞凋亡。AHL強烈誘導(dǎo)巨噬細胞和中性粒細胞凋亡。此外，AHL以劑量依賴性方式促進精子凋亡，從而降低精子活力。AHL對癌細胞也有較強的促凋亡作用。

  4.2 AHL對免疫的影響

根據(jù)酰基鏈長度、雙鍵和濃度，AHL可以不同程度地影響宿主先天免疫系統(tǒng)。對于巨噬細胞，AHL通常以多種方式降低其炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致銅綠假單胞菌的慢性感染。結(jié)果表明，銅綠假單胞菌產(chǎn)生的AHL在RAW264.7小鼠巨噬細胞中具有抗炎作用，且呈劑量依賴性。同時，AHL誘導(dǎo)RAW264.7細胞分泌的TNF-α濃度降低，IL-10濃度升高。此外，有報道稱AHL存在時巨噬細胞具有更強的吞噬活性。對于樹突狀細胞(DCs)，其作用因細胞類型而異。在AHL存在的情況下，脂多糖刺激可抑制人和小鼠DCs中促炎細胞因子IL-12和干擾素-γ的分泌。然而，相同濃度的AHL和脂多糖只能增強人DCs分泌IL-10的能力，而不能增強小鼠DCs分泌IL-10的能力。AHL對宿主適應(yīng)性免疫也有一定程度的影響。AHL能抑制有絲裂原刺激和抗原刺激的T淋巴細胞增殖和功能，并能調(diào)節(jié)B淋巴細胞產(chǎn)生抗體。此外，AHL可通過線粒體途徑誘導(dǎo)Jurkat細胞系凋亡，從而抑制DCs和T細胞的活化和增殖，并下調(diào)DCs上共刺激分子的表達。

4.3 AHL影響宿主細胞功能的細胞類型特異性和劑量特異性

AHL誘導(dǎo)哺乳動物細胞凋亡具有明顯的細胞特異性。例如，大量體外研究表明，AHL可誘導(dǎo)氣管上皮細胞、乳腺癌細胞、巨噬細胞和中性粒細胞凋亡，但對肝Hep2和肺CCL185上皮細胞系不具有誘導(dǎo)凋亡作用。AHL對哺乳動物細胞免疫的調(diào)節(jié)也具有細胞類型特異性，有研究報道AHL可以上調(diào)炎癥細胞因子，但也有研究表明AHL可以減少細胞炎癥。此外，AHL對宿主細胞功能的影響同樣具有劑量特異性。在較高濃度(>25 μM)下，細胞內(nèi)事件可能占主導(dǎo)地位，但在較低濃度(<10 μM)下，更敏感的受體驅(qū)動效應(yīng)將占主導(dǎo)地位。較低濃度(10~30 μM)的AHL可通過抑制未分化Caco-2細胞中的AKT磷酸化來降低細胞活力，并伴有細胞凋亡。在臨床環(huán)境中，胃腸道被認為是產(chǎn)生AHL的銅綠假單胞菌重要的棲息地，其與較高的患者死亡率相關(guān)。人體臨床研究表明，銅綠假單胞菌具有黏附和穿透腸上皮細胞以及形成生物膜的能力。AHL存在于銅綠假單胞菌生物膜中，濃度高達300-600 μM。因此，我們前面列出的AHL影響宿主細胞功能的研究中使用的濃度具有生理學(xué)意義，這些研究有助于指導(dǎo)臨床實踐。

  4.4 AHL影響宿主細胞功能的潛在機制

雖然AHLs觸發(fā)宿主細胞損傷的分子機制尚未明確，對哺乳動物細胞中已鑒定的AHL受體靶點的研究仍處于早期階段，但已闡明了幾種介導(dǎo)AHL活性的信號通路和機制。通常，當病原微生物及其代謝物入侵時，宿主通過模式識別受體(PPRs)激活先天免疫系統(tǒng)。toll樣受體(TLRs)是PRR的一種，能夠直接激活免疫反應(yīng)。據(jù)報道，AHL可調(diào)節(jié)中性粒細胞吞噬作用并抑制DC抗原呈遞，從而誘導(dǎo)促炎細胞因子并加劇氣道炎癥。AHL也被報道能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的核因子-κB(NF-κB)激活，從而觸發(fā)淋巴細胞死亡。已有研究證明宿主響應(yīng)AHL不需要TLR。在之前的一項研究中，我們發(fā)現(xiàn)雖然AHL處理后TLRs表達發(fā)生了改變，但NF-κB磷酸化并未發(fā)生改變。此外，NF-κB轉(zhuǎn)錄活性抑制劑并不能減輕AHL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細胞活力，表明TLR-NF-κB信號通路不參與AHL誘導(dǎo)的宿主細胞損傷。因此，AHL的效應(yīng)功能似乎是通過一個獨特的信號平臺發(fā)生的。

脂筏是質(zhì)膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結(jié)構(gòu)域。脂筏是蛋白質(zhì)停泊的平臺，與膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)分選密切相關(guān)。脂筏可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中形成，一些脂筏運輸?shù)郊毎ず罂刹煌潭鹊嘏c膜下細胞骨架蛋白交聯(lián)。目前，關(guān)于脂筏是否介導(dǎo)AHLs對宿主的有害生物學(xué)功能尚未達成共識。由于AHL是一種脂溶性小分子，有報道稱細胞膜上的膽固醇是AHL的潛在受體，AHL可以通過細胞膜上的脂筏運輸?shù)郊毎麅?nèi)執(zhí)行特定的生物學(xué)功能。脂筏的破壞者MβCD通過移除細胞膜上的膽固醇來破壞脂筏的結(jié)構(gòu)，能有效抑制AHL誘導(dǎo)的Caco-2細胞通透性增加。然而，另一篇報道表明AHL可通過被動運輸途徑進入宿主細胞，與細胞膜幾乎沒有相互作用。研究結(jié)果出現(xiàn)這種差異的原因可能是由于使用的細胞類型不同，但脂筏和AHL之間的關(guān)系仍需進一步研究。

目前，AHLs調(diào)節(jié)宿主細胞功能的機制尚不清楚，宿主細胞結(jié)合AHLs的受體尚未確定。然而，有人提出過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)可能作為哺乳動物AHL的潛在受體。PPAR-γ是一種核受體，作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。以往對PPAR-γ的研究主要集中在調(diào)節(jié)脂肪細胞的分化，而對其介導(dǎo)細胞凋亡的研究較少。體外研究也證實PPAR-γ激動劑可以在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的T細胞凋亡，這表明PPAR-γ激動劑是一種潛在的抗炎分子，在嚴重炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮免疫功能障礙的作用。PPAR-γ表達增加也可誘導(dǎo)癌細胞凋亡，但對于神經(jīng)元細胞則相反，PPAR-γ過表達或其受體激動劑羅格列酮都可以通過上調(diào)抗凋亡蛋白來保護線粒體，從而發(fā)揮抗凋亡作用。

對氧磷酶2(PON2)