病原體宏基因組測序未來？一文了解新進展

微生物診斷技術(shù)

傳統(tǒng)的微生物診斷技術(shù)包括使用培養(yǎng)物（介質(zhì)和瓊脂）、病原體相關(guān)抗體的血清學(xué)檢查，以及采用PCR技術(shù)對微生物遺傳物質(zhì)（DNA 或 RNA）進行檢測。然而，這些技術(shù)存在較大的應(yīng)用范圍限制。通過使用特定的培養(yǎng)條件、抗原或引物，只能檢測到一部分病原體。此外，有些技術(shù)方法（如微生物培養(yǎng)）敏感性較低，無法捕獲微生物負載較低的微生物，或不適用于無法進行體外培養(yǎng)的微生物。 為了克服這些挑戰(zhàn)，人們對于使用宏基因組學(xué)技術(shù)來分析患者樣本中的 DNA/RNA 信息越來越感興趣，這些信息包括全微生物組信息，以及人類宿主基因組或轉(zhuǎn)錄組信息1。以宏基因組學(xué)為技術(shù)開展鑒定分析其實早有先例，并已廣泛應(yīng)用于環(huán)境樣本和法醫(yī)樣本的特征鑒定。 本文將重點解釋如何使用宏基因組學(xué)方法來加強傳染病監(jiān)測，以及如何獲得臨床穩(wěn)健性。

宏基因組學(xué)在傳染病監(jiān)測中的應(yīng)用 目前，宏基因組分析法采用的是下一代測序（NGS）技術(shù)。相比微陣列技術(shù)，NGS 的通量更高。NGS 技術(shù)在單次運行中可產(chǎn)生數(shù)百萬次到數(shù)十億次的序列，以對臨床樣本進行全面分析。而且，NGS 還因降低了成本而備受贊譽。基于上述優(yōu)勢，NGS 已成為宏基因組學(xué)的主要技術(shù)，并在識別抗生素耐藥性2和傳染病暴發(fā)的原因方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用3。 宏基因組下一代測序（mNGS）的典型工作流程如下：首先，提取總核酸（DNA 和 RNA）。其次，將 RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補 cDNA。隨后，使用 Illumina 和 Oxford Nanopore Technologies 等公司的儀器對 DNA 和 cDNA 進行測序，并將其比對至參考基因組中，以確定其中所存在的微生物種類以及相對數(shù)量。 若要提高對低數(shù)量級病原體的檢測靈敏度，可在探針捕獲富集核酸的步驟中加入磁珠。 與 mNGS 相比，分子 PCR 診斷方法具有明顯的成本和時間優(yōu)勢，如 mNGS 測序周期近 20 小時，而后者僅需 2 小時左右。不過，mNGS 也有其獨特優(yōu)勢，如檢測范圍更廣，可根據(jù)可識別 DNA 或 RNA 序列，直接從臨床樣本中識別出病毒、細菌、真菌和寄生蟲等病原體4。 此外，mNGS 數(shù)據(jù)還可以與其他表征技術(shù)（包括人類宿主反應(yīng)的 RNA 測序技術(shù)）相結(jié)合，以更好地了解疾病的進展以及患者對病原體和療法的反應(yīng)。 我國研究人員利用 mNGS 診斷方法來檢測社區(qū)獲得性肺炎（CAP）。引起 CAP 的病原體或涉及 100 多種病毒、細菌、真菌和寄生蟲5。但是由于對罕見病原體的診斷數(shù)據(jù)缺乏，加之苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)難度高，仍有高達 62% 的 CAP 病例無法診斷出來。 該團隊共招募了 159 名患者：100 例樣本用常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)進行檢測，其余 59 例則使用 mNGS 診斷技術(shù)進行檢測。兩個研究組別在多項健康指標上無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果表明，mNGS 能夠檢測到的病原體范圍更廣。

具體而言，mNGS 檢測出了 179 種病原體（其中細菌 113 種，真菌 32 種，病毒 34 種），相比對照組所檢測出的 105 種病原體（細菌 78 種，真菌 27 種），多了近 70%。

這是 mNGS 診斷技術(shù)的一大關(guān)鍵優(yōu)勢，因為超過 50% 的 CAP 陽性患者存在細菌、真菌和病毒的混合感染。重要的是，數(shù)據(jù)表明，mNGS 檢測組的疾病緩解率（63%）高于對照組（7%），醫(yī)院死亡率更低（8.6% VS 26%），這是由于 mNGS 診斷結(jié)果的準確性帶來了治療方案的改變。盡管 mNGS 在傳染病監(jiān)測方面很有前景，但仍面臨不少挑戰(zhàn)。例如，通常而言，非人類遺傳物質(zhì)的序列僅占<1%。因此，檢測的靈敏度在很大程度上取決于宿主基因組物質(zhì)背景的情況。一般來說，無細胞液體樣本比組織樣本具有更高的靈敏度。此外，定義非無菌樣品中的微生物種群也具有挑戰(zhàn)性，因為其中或存在環(huán)境微生物污染。

更快且成本更低的工作流程

mNGS 的另一局限之處在于，該過程至少需要 20 個小時，甚至可能長達數(shù)日，其中涉及的過程包括核酸提取和 RNA 逆轉(zhuǎn)錄等多個步驟。此外，由于 mNGS 對人力的需求高以及消耗性成本高，也使其無法用于資源匱乏地區(qū)的傳染病監(jiān)測。 為了克服這一問題，上海公共衛(wèi)生臨床中心的研究人員創(chuàng)建了一套簡化版臨床宏基因組測序方案。該團隊采用離液鹽基緩沖液，結(jié)合珠磨破碎法來增強裂解和 DNA 的提取效果，隨后建立 Illumina 測序文庫。在這一實驗過程中無需昂貴的核酸提取試劑盒，也不需要其他步驟如樣品預(yù)處理、去除宿主和病原體富集等。 整個過程（20個樣本）耗時約 8 小時，對乙肝陽性血清和甲型流感病毒庫等類型的樣本覆蓋率。這一高覆蓋率對于將測序 DNA 映射到已知參考基因尤為重要。甲型流感樣本被連續(xù)稀釋 10000 倍后，雖然覆蓋率會因此降低到 26%，但依然可以在低病毒載量下對病毒進行可靠識別。 之后，研究團隊將 mNGS 工作流應(yīng)用于臨床樣本，其中包括腦膜炎/腦炎患者的 20 個腦脊液樣本，這些患者的大腦/脊髓存在微生物感染。測序過程中發(fā)現(xiàn)有樣本中存在剛地弓形蟲序列，隨后再次取樣開展抗體檢測，結(jié)果確呈陽性。 從簡化版 mNGS 獲得的研究結(jié)果來看，工作流程經(jīng)優(yōu)化后，DNA 提取和變性效率得以提升，但仍具有與傳統(tǒng) mNGS 同樣的靈敏度，并且可以實現(xiàn)以更低成本提供高通量診斷。 上海市公共衛(wèi)生臨床中心首席研究員、堪培拉大學(xué)副教授張小楠博士說：“臨床宏基因組測序作為一種無偏識別病原體的診斷工具，除了研究用途外，也越來越多地應(yīng)用于臨床。然而，如果要在資源匱乏的國家應(yīng)用這項技術(shù)，那么仍需要進一步降低流程復(fù)雜性和總成本?！?/p>

克服假陽性

血液感染會導(dǎo)致敗血癥和感染性休克，與高發(fā)病率和高死亡率密切相關(guān)。而 mNGS 方法可以提高病原體識別效率，從而對癥下藥，同時可以幫助我們理解為何患者對不同療法的療效有差異。 盡管 mNGS 在血液病原體檢測方面成效好，但由于標本采集過程中所伴隨的污染，尤其是來自實驗室試劑和環(huán)境中的人源菌群和背景微生物，使得 mNGS 診斷結(jié)果仍存在很高的假陽性率6。 北京大學(xué)人民醫(yī)院的研究人員試圖通過將多個對照組數(shù)據(jù)作為數(shù)據(jù)過濾器來克服 mNGS 的高假陽性率。該研究設(shè)立了三個對照組：陰性樣本對照組、健康人群樣本對照組和經(jīng)長期監(jiān)測以識別常見微生物污染物的外部陰性對照組。為了過濾掉一些由親緣關(guān)系度高的類群帶來的假陽性干擾，該團隊還引入了兩個標記物。 這一改進的系統(tǒng)可提供與血液培養(yǎng)相類似的靈敏度和特異性，不過需要幾天的時間，也不能用于檢測苛養(yǎng)菌。值得注意的是，改進后的系統(tǒng)在檢測真菌病原體方面優(yōu)于其他臨床方法。 然而，該系統(tǒng)未能在 12 個樣本中檢測到血液感染。對此，作者解釋說，這可能是由于在感染的早期階段，細胞游離 DNA 的可提取性較低，以及過濾器的嚴格程度問題。他們也提出進一步假設(shè)，如果用更多的陽性和陰性樣本來改進過濾器，那么這一方案能呈現(xiàn)出來的檢測性能或?qū)⑦M一步提升。

加強跨機構(gòu)合作

這一領(lǐng)域看似很有前途，但 mNGS 結(jié)果受限于獨立實驗室、實驗協(xié)議和工作流程，以及參考標準。這就導(dǎo)致了，如果醫(yī)療保健機構(gòu)在執(zhí)行傳染病暴發(fā)監(jiān)測等任務(wù)時，希望對比不同地區(qū)的監(jiān)測數(shù)據(jù)，這一需求變得極具挑戰(zhàn)性。 中國食品藥品檢定研究院（北京）的研究人員主導(dǎo)了一項多中心評價項目，由17個獨立實驗室共同使用一套通用的參比試劑和性能指標，來比較 mNGS 檢測結(jié)果。研究人員希望這一工作可以在建立性能標準、指導(dǎo)結(jié)果解釋、推動試驗和工作流程開發(fā)、提高合規(guī)審批通過率方面帶來新的機會9。 為了模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染，該團隊構(gòu)建了一組參考試劑，包含 9 種病原體，覆蓋 30 種以人類宿主細胞為生存背景的微生物。其中部分細菌種類具有一定的親緣關(guān)系，這是為了確定其是否會被 mNGS 方法識別出來。 為了確定檢測的動態(tài)范圍，研究人員所采用的微生物的基因組大小和GC含量較為廣泛，其中基因組大小從0.7Kb 到 19.05Mb，GC 含量從 33.2% 到 70.4%。同時，也采取了一系列策略以提高檢測結(jié)果，包括消耗宿主細胞策略和使用污染物過濾器。 測試結(jié)果的平均運行時間約為 24 小時，其中測序步驟耗時久。因此，作者建議讀取長度為 75 個堿基對（或更少），從而使宏基因組分析更高效。作者還表示，希望隨著更高基因組覆蓋率的產(chǎn)生，可以開發(fā)出更為復(fù)雜的識別算法，屆時，mNGS 或?qū)⒕哂懈鼮閺姶蟮臄?shù)據(jù)特異性，并有可能成為合規(guī)或技術(shù)標準建立的一種手段。 中國食品藥品檢定研究院劉東來博士說：“我們所做的工作可以說是鳥槍法宏基因組學(xué)在病原體檢測領(lǐng)域全面的基準研究，包括對其可靠性、關(guān)鍵性能決定因素、可重復(fù)性和量化潛力進行評價。這項工作為臨床和監(jiān)管機構(gòu)的技術(shù)評估提供了一個包含近 6000 億次讀?。?gt;5Tb）的獨特資源。我們相信，我們的多中心分析項目對于推動鳥槍法宏基因組學(xué)相關(guān)實驗技術(shù)的進一步發(fā)展和生物信息學(xué)工具的進一步開發(fā)而言，十分有價值?！?/p>

未來發(fā)展

傳染病仍然是世界上大的死亡原因之一。然而，隨著監(jiān)測技術(shù)的進一步優(yōu)化，或可通過及早發(fā)現(xiàn)病原體，從而挽救更多的生命。 雖然 mNGS 技術(shù)仍存在運行時間長、靈敏度低等局限性，但不可否認的是，這是一種比培養(yǎng)法更為可靠的病原體檢測方法。此外，與分子 PCR 診斷技術(shù)相比，mNGS 診斷方法覆蓋的病原體更為廣泛，經(jīng)證實，也可用于識別多種病原菌合并感染的鑒定。 隨著樣本處理方法、假陽性信號過濾算法以及跨機構(gòu)算法差異的改進，mNGS 診斷技術(shù)有望在傳染病的臨床監(jiān)測中發(fā)揮越來越重要的作用。