一項(xiàng)對(duì)復(fù)發(fā)髓母細(xì)胞瘤的研究揭示復(fù)發(fā)髓母細(xì)胞瘤的分子生物學(xué)特征

研究背景

經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)治療后，約1/3的髓母細(xì)胞瘤（Medulloblastoma，MB）患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后患者長(zhǎng)期生存的概率很低。但復(fù)發(fā)髓母細(xì)胞瘤的遺傳學(xué)特征尚缺乏研究。了解復(fù)發(fā)髓母細(xì)胞瘤的關(guān)鍵分子生物學(xué)事件及其與初發(fā)腫瘤的關(guān)系是未來(lái)開(kāi)發(fā)新治療手段的關(guān)鍵。

近10年來(lái)，基因組學(xué)研究的發(fā)展揭示了髓母細(xì)胞瘤的分子生物學(xué)特征。每個(gè)分子亞型的遺傳學(xué)機(jī)制，流行病學(xué)特征和預(yù)后不同。目前已經(jīng)確定了一些有效的預(yù)后標(biāo)志，如SHH型腫瘤中的TP53突變和MYCN擴(kuò)增，G3型腫瘤中的MYC擴(kuò)增。這為初發(fā)髓母細(xì)胞瘤的診斷和創(chuàng)新治療提供了理論基礎(chǔ)。然而，針對(duì)復(fù)發(fā)髓母細(xì)胞瘤的同類(lèi)型研究較為缺乏，這主要是由于復(fù)發(fā)時(shí)接受手術(shù)的比例較低。本研究歸納了119例復(fù)發(fā)髓母細(xì)胞瘤的遺傳學(xué)特征，確定了復(fù)發(fā)髓母細(xì)胞瘤的關(guān)鍵遺傳學(xué)事件，并分析了它們?cè)诩膊∵M(jìn)展過(guò)程中的演變。

研究方法

本研究共獲取了來(lái)自英國(guó)CCLG的57例復(fù)發(fā)髓母細(xì)胞瘤樣本（其中55例有對(duì)應(yīng)的初發(fā)腫瘤樣本）。另28例復(fù)發(fā)MB樣本用于DNA甲基化分析。為明確髓母細(xì)胞瘤的診斷，除常規(guī)病理檢查外，還進(jìn)行了DNA甲基化分型。本研究中，4例樣本因甲基化特征不符合MB而被排除（2例尤文肉瘤，2例GBM）。為擴(kuò)大樣本量，還獲取了ICGC提供的38例復(fù)發(fā)MB的二代測(cè)序結(jié)果，因此本研究共納入了119例復(fù)發(fā)MB。另外研究者對(duì)比了一項(xiàng)對(duì)282例初發(fā)髓母細(xì)胞瘤的研究數(shù)據(jù)（包括分子分型、DNA甲基化及基因突變數(shù)據(jù)）（Northcott PA et al, Nature, 2017）。

本研究對(duì)腫瘤進(jìn)行分子分型，其中SHH型腫瘤細(xì)分為嬰幼兒型（＜4歲，共10例）和非嬰幼兒型。并分析了腫瘤染色體臂水平的拷貝數(shù)變異（CNV）和焦點(diǎn)拷貝數(shù)變異。其中焦點(diǎn)拷貝數(shù)變異共分析了63個(gè)關(guān)鍵基因所在的位點(diǎn)（＜12Mb）。在基因突變分析中，共分析了71個(gè)關(guān)鍵基因的突變，包括初發(fā)MB的高頻驅(qū)動(dòng)基因突變，以及在腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)獲得的致病性基因突變。CNV和基因突變的狀態(tài)分為“獲得”（初發(fā)腫瘤不存在，復(fù)發(fā)腫瘤存在）；“維持”（初發(fā)和復(fù)發(fā)腫瘤均存在）；“確診時(shí)未知”（無(wú)法獲得原發(fā)腫瘤數(shù)據(jù)，復(fù)發(fā)腫瘤存在）。另外研究者分析了與復(fù)發(fā)MB相關(guān)的信號(hào)通路的改變。

研究結(jié)果

1、腫瘤的分子分型（分子亞型）在復(fù)發(fā)時(shí)保持恒定

腫瘤的分子分型（包括新的分子亞型）在復(fù)發(fā)時(shí)與初發(fā)一致，但也有例外。在57例可進(jìn)行DNA甲基化分析的腫瘤中，56例（98%）在初發(fā)時(shí)和復(fù)發(fā)時(shí)的分子亞型一致。在SHH型中，18/20（90%）例腫瘤的分子亞型在復(fù)發(fā)時(shí)與初發(fā)一致。在G3&G4型中，4例腫瘤的分子亞型在復(fù)發(fā)時(shí)發(fā)生改變（4/24）。在初發(fā)時(shí)均為VIII亞型，而復(fù)發(fā)時(shí)3例變?yōu)閂亞型，1例變?yōu)閂II亞型。無(wú)高頻的分子遺傳學(xué)改變與上述亞型的變化現(xiàn)象相關(guān)。

2、復(fù)發(fā)MB的預(yù)后與分子分型和復(fù)發(fā)時(shí)是否接受CSI相關(guān)

正如預(yù)期的那樣，在有生存數(shù)據(jù)的患者中，不同分子分型的患者從確診到復(fù)發(fā)的時(shí)間間隔有顯著差異（p=0.002）。分子分型也與復(fù)發(fā)后的疾病進(jìn)展有關(guān)。

3、復(fù)發(fā)時(shí)遺傳事件的產(chǎn)生和維持在不同分型之間存在差異

在復(fù)發(fā)MB中，拷貝數(shù)變異CNVs和驅(qū)動(dòng)基因突變較初發(fā)腫瘤發(fā)生了顯著的變化。總體而言，40%（239/597）的遺傳學(xué)事件是新發(fā)的。但大多數(shù)遺傳事件（60%）與初發(fā)腫瘤保持一致。復(fù)發(fā)MB遺傳事件改變的類(lèi)型以及頻率在不同分型之間也存在顯著差異，其中G4型的改變多，而WNT型和G3型的改變相對(duì)較少?？傮w而言，在復(fù)發(fā)時(shí)獲得的致病性基因突變的總量在各個(gè)亞組之間是相等的。

4、各型腫瘤在復(fù)發(fā)時(shí)的遺傳學(xué)特征

☆ SHH嬰幼兒亞型和SHH非嬰幼兒亞型在復(fù)發(fā)時(shí)遺傳學(xué)特征不同

SHH嬰幼兒亞型和非嬰幼兒亞型在復(fù)發(fā)時(shí)獲得的遺傳學(xué)改變?cè)陬?lèi)型和頻率上存在差異，非嬰幼兒亞型在復(fù)發(fā)時(shí)染色體臂層面的改變多于嬰幼兒亞型（59%,70/119 vs 32%,20/62，p＜0.001）。但是，與嬰幼兒型相比，非嬰幼兒型獲得的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因突變明顯較少（7%,5/72 vs 32% 13/41，p=0.001）。SHH通路相關(guān)基因突變?cè)谶@兩型中均較為常見(jiàn)，且在復(fù)發(fā)時(shí)得以保持（嬰幼兒型6/6，非嬰幼兒型6/8）。

在SHH嬰幼兒亞型中，關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)基因突變和CNVs的數(shù)量在復(fù)發(fā)時(shí)沒(méi)有顯著的增加，本研究中33%的復(fù)發(fā)腫瘤（4/12）存在15號(hào)染色體的獲得，而對(duì)照初發(fā)隊(duì)列未發(fā)現(xiàn)此改變（0/23）。在SHH非嬰幼兒亞型中，復(fù)發(fā)時(shí)染色體臂層面CNVs顯著增多（p=0.044）。與初發(fā)腫瘤相比，復(fù)發(fā)腫瘤染色體4p/4q獲得和10p缺失明顯增多。復(fù)發(fā)時(shí)焦點(diǎn)CNV和驅(qū)動(dòng)基因突變的數(shù)量沒(méi)有顯著增加。但TP53突變除外（復(fù)發(fā)8/19 vs 初發(fā)6/59；p=0.004）。TP53突變腫瘤染色體臂層面CNVs數(shù)量增加（突變型8.14 vs 野生型3.8）。未觀察到MYCN擴(kuò)增在復(fù)發(fā)腫瘤中的增加。

☆ TP53突變?cè)趶?fù)發(fā)WNT型腫瘤中普遍存在

復(fù)發(fā)時(shí)WNT型腫瘤常見(jiàn)的遺傳學(xué)改變是6號(hào)染色體單體和CTNNB1突變（5/5，100%），并得以保留。4例腫瘤存在TP53突變，并從初發(fā)時(shí)得到保留。與對(duì)照的初發(fā)腫瘤相比，TP53突變的比例明顯較高（對(duì)照組3/24）。

☆ G3型腫瘤在復(fù)發(fā)時(shí)出現(xiàn)新的遺傳事件較少

復(fù)發(fā)G3型腫瘤中新出現(xiàn)的驅(qū)動(dòng)基因突變和焦點(diǎn)CNV較少，但與初發(fā)隊(duì)列相比，染色體2q獲得和15號(hào)染色體丟失的比例較高。

☆ G4型腫瘤在復(fù)發(fā)時(shí)出現(xiàn)新的遺傳事件較多

G4型腫瘤在復(fù)發(fā)時(shí)的遺傳學(xué)特征與初發(fā)時(shí)的差異大。復(fù)發(fā)時(shí)基因突變和CNV的數(shù)量明顯增多。在染色體臂水平，復(fù)發(fā)腫瘤17p和11p缺失的比例較高（20/25和10/25），主要是從初發(fā)時(shí)維持至復(fù)發(fā)。而復(fù)發(fā)時(shí)9p、10p、20p和20q的缺失也明顯增多，主要是在復(fù)發(fā)時(shí)獲得。復(fù)發(fā)G4型腫瘤出現(xiàn)焦點(diǎn)CNV事件很少，但CDK6和CDK14的共擴(kuò)增明顯增多，這一改變主要在復(fù)發(fā)時(shí)獲得，并出現(xiàn)在21%（4/19）的腫瘤中。初發(fā)G4型腫瘤的驅(qū)動(dòng)基因突變較少，但復(fù)發(fā)腫瘤中可發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)高頻突變，其中USH2A、DDX3X、CHD7、NEB、EPHA7、GTF3C1的比例明顯高于初發(fā)隊(duì)列。值得注意的是，致病性的USH2A突變常見(jiàn)（圖4F），在復(fù)發(fā)G4型腫瘤中的比例為17%（4/23），其中2例自初發(fā)時(shí)維持，另2例在復(fù)發(fā)時(shí)獲得。而初發(fā)腫瘤中未發(fā)現(xiàn)該突變。

5、復(fù)發(fā)MB的信號(hào)傳導(dǎo)通路存在異常

復(fù)發(fā)MB中存在某些關(guān)鍵信號(hào)通路的改變，包括染色質(zhì)修飾、PI3K-Akt、細(xì)胞周期和DNA損傷修復(fù)（DDR）相關(guān)通路。研究者對(duì)具有完整基因突變和CNV數(shù)據(jù)的29例腫瘤的信號(hào)通路的改變進(jìn)行研究。共55%（16/29）的復(fù)發(fā)MB存在DDR/細(xì)胞周期相關(guān)通路的改變，除TP53突變外（7/29），其他DDR通路相關(guān)基因的高頻突變包括ATM和BRCA2突變。DDR相關(guān)基因的改變?cè)谒蟹中椭芯梢?jiàn)，但主要發(fā)生于SHH非嬰幼兒亞型和G4型，主要由初發(fā)維持至復(fù)發(fā)。55%（16/29）的復(fù)發(fā)MB存在與染色質(zhì)修飾通路相關(guān)的異常事件，在所有分型中均常見(jiàn)，主要在復(fù)發(fā)時(shí)獲得。但沒(méi)有高頻基因突變，主要由一系列低頻事件引起。PI3K-AKT通路的改變發(fā)生于28%的腫瘤（8/29），在所有分型中均可見(jiàn)，主要在復(fù)發(fā)時(shí)獲得。PTEN突變或CNV常見(jiàn)（3/29，10%）。

6、特定的遺傳學(xué)事件可預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)MB的預(yù)后

腫瘤復(fù)發(fā)后的生存時(shí)間與分子分型相關(guān)，另外，在單因素分析中，TP53突變、MYCN擴(kuò)增和3p缺失與較差的預(yù)后相關(guān)（圖6）。TP53突變是復(fù)發(fā)時(shí)常見(jiàn)的不良預(yù)后事件（9/36,25%）。所有存在該突變的患者復(fù)發(fā)后生存時(shí)間小于2年。值得注意的是，在單因素分析中，腫瘤解剖部位，復(fù)發(fā)時(shí)接受的治療（化療，局部或全中樞放療）與預(yù)后無(wú)關(guān)（補(bǔ)充表3）。多因素分析確定了TP53突變?yōu)椴焕莫?dú)立危險(xiǎn)因素，而染色體9q缺失是有利的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。與復(fù)發(fā)腫瘤預(yù)后相關(guān)的4個(gè)改變：TP53突變、MYCN擴(kuò)增、3p缺失、9q缺失中，有40%是復(fù)發(fā)時(shí)獲得的。

討論

了解髓母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)時(shí)遺傳學(xué)特征的變化對(duì)指導(dǎo)治療和改善預(yù)后至關(guān)重要。大多數(shù)復(fù)發(fā)腫瘤的分子分型和亞型與原發(fā)腫瘤一致。Kumar等的研究報(bào)告了69例復(fù)發(fā)G3和G4型MB中有15例發(fā)生亞型改變，并與MYC擴(kuò)增和染色體2p獲得相關(guān)。但此類(lèi)病例數(shù)量較少，因此這一現(xiàn)象的生物學(xué)特征和臨床意義有待進(jìn)一步研究。在分子分型保持一致的前提下，腫瘤驅(qū)動(dòng)基因的突變以及CNV的出現(xiàn)和維持是復(fù)發(fā)髓母細(xì)胞瘤的主要遺傳學(xué)特征。

本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)髓母細(xì)胞瘤中約40%的遺傳學(xué)事件是在復(fù)發(fā)時(shí)新獲得的，而且在不同亞型之間有顯著的差異。非嬰幼兒SHH型腫瘤在復(fù)發(fā)時(shí)染色體臂水平的CNV明顯增多，并與TP53突變相關(guān)。而G4型腫瘤在復(fù)發(fā)時(shí)出現(xiàn)的遺傳學(xué)改變多，包括CDK6/CDK14和USH2A突變，這提供了潛在的靶向治療機(jī)會(huì)。USH2A突變的發(fā)現(xiàn)可能提示G4型腫瘤復(fù)發(fā)的新機(jī)制，特別是考慮到該基因的異常在其他疾?。ㄈ缫暰W(wǎng)膜色素變性和Usher綜合征）的作用。另外，復(fù)發(fā)髓母細(xì)胞瘤中60%的遺傳學(xué)事件在初發(fā)時(shí)即存在，包括WNT型和SHH型通路相關(guān)基因的突變（CTNNB1、PTCH1、SUFU、SMO等）。這些關(guān)鍵基因突變的維持提示它們?cè)谀[瘤發(fā)展的全程中發(fā)揮作用，因此一旦發(fā)現(xiàn)，可在整個(gè)病程中指導(dǎo)靶向藥物的選擇（如SMO抑制劑）。本研究中，大多數(shù)WNT型腫瘤（4/5）在復(fù)發(fā)時(shí)存在TP53突變，這與既往研究形成對(duì)比，即TP53突變?cè)赪NT型腫瘤中與預(yù)后無(wú)關(guān)，這一點(diǎn)需要進(jìn)一步研究。

另外，復(fù)發(fā)髓母細(xì)胞瘤存在特定分子通路的改變，如DNA損傷修復(fù)、染色質(zhì)修飾、PI3K-AKT信號(hào)通路。這為進(jìn)一步研究與信號(hào)通路相關(guān)的治療手段提供了機(jī)會(huì)。另外，復(fù)發(fā)后特定的遺傳學(xué)事件，如TP53突變、MYCN擴(kuò)增、3p缺失、9q缺失與預(yù)后相關(guān)。這提示在腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)也有必要進(jìn)行分子病理檢測(cè)，以指導(dǎo)治療。